Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Обучение > Стерильная работа.

Стерильная работа.

Стерильная работа это не набор методов, а скорее определённый стиль работы. Под "стилем" мы подразумеваем то, что качество работы определяется в этом случае не "максимальными", а "минимальными достижениями".
     Работать так, чтобы не возникало загрязнений, совсем не сложно, проблема лишь в том, что так нужно работать всегда (вне зависимости от вашего настроения и состояния).

    Основные правила.

  • Правила стерильной работы практически идентичны для бактерий и клеток эукариот. Разница лишь в том, что:
    1. бактерии обычно более терпимо относятся к их нарушению;
    2. очистка ценной бактериальной культуры - существенно более простая задача, чем очистка культуры эукариотической;
    3. стоимость загубленной бактериальной культуры гораздо ниже, чем загубленной эукариотической.
  • Главное правило: постарайтесь организовать работу так, чтобы чистые и "грязные" растворы и инструменты находились друг от друга как можно дальше во времени и пространстве.
    1. разнесение во времени - вначале подготовьте стерильные среды, разлейте их по пробиркам/чашкам и лишь когда работа закончена и стоковые растворы убраны из под ламинара, вносите под него ваши культуры клеток;
    2. разнесение в пространстве - например, требуется стерильными зубочистками перенести отдельные бактериальные колонии в пробирки с ростовой средой. Удобнее и безопаснее, если предметы под ламинаром будут расположены таким образом, чтобы отдельная зубочистка двигалась слева направо и никогда не возвращалась назад:

    Стерильный пинцет. Стаканчик со стерильными зубочистками. Чашка с бактериями. Пробирки с ростовой средой. Мусорница.

  • Под "грязными" подразумеваются либо нестерильные, либо содержащие живые клетки объекты. В этом смысле матрас с эукариотическими клетками, с которым вы стараетесь работать как можно более аккуратно, тоже надо рассматривать как "грязный".
  • Грязь падает сверху, поэтому постарайтесь:
  • - ничего не проносить над открытыми ёмкостями и перевёрнутыми пробками;
    - не оставлять открытыми дольше, чем это необходимо коробки с типами, банки со средами, пробирки, чашки Петри, культуральные матрасы.

  • Особенно внимательно относитесь к тем местам инструментов, откуда грязь способна легко проникнуть в среду:
  • - не прикасайтесь к горлышку рядом с пробкой (удобно использовать крышки из фольги);
    - внимательно работайте с алюминиевым пеналом со стерильными пипетками, доставайте из него пипетки только стерильным пинцетом.

  • При стерилизации автоклавированием и прокаливанием стоит иметь в виду, что
  • - когда вы достаёте какую либо ёмкость из автоклава воздух в ней горячий. При остывании он сжимается и подсасывает воздух снаружи. Нужно, чтобы этот воздух был не слишком грязным.
    - если прокаливается перевёрнутая влажная колба, то водяные пары остаются внутри (молекулярный вес воды меньше, чем воздуха). Когда колба остынет, пар вновь сконденсируется и колба окажется изнутри влажной.

    Что делать, если случился "зарост".

  • Заросшая банка или чашка - это разрыв в стерильной работе. Важно не дать ему распространиться. Правила "локализации" проблемы:
    1. Открывать заросшие ёмкости очень опасно - многие бактериофаги и споры грибов летучи. Нужно не полениться и вылить заросшую среду в туалет и там же сполоснуть банку (если выливать в лабораторную раковину - возможны брызги, а значит - распространение проблемы).
    2. Нужно иметь очень веские причины для продолжения работы с заросшей чашкой. Но даже если такие причины найдутся лучше сделать эту работу как можно более кратковременной. В ЛЮБОМ СЛУЧАЕ НЕ ПОД ЛАМИНАРОМ.
  • При работе с бактериями возможно (у нас ещё никогда не было) появление на чашке очень крупных (0.5-3cm) бляшек бактериофагов. Это не фаг лямбда, и не M13, а очень опасная лабораторная проблема. Такую чашку нельзя открывать ни в коем случае. Её нужно аккуратно поместить в полиэтиленовый пакет и выбросить (даже если чашка стеклянная), причём лучше на улицу, в контейнер.
  • Работа под ламинаром.

  • НЕДОПУСТИМО, чтобы в одном ламинаре проводилась работа с бактериями, дрожжами и клетками высших эукариот. Обычно требуется использовать даже различные комнаты.
  • Если в один и тот же день приходится работать и с бактериями и с дрожжами и с клетками высших эукариот, лучше спланировать день так, чтобы порядок работы был:
  • Высшие эукариоты;
    Дрожжи;
    Бактерии.

  • Порядок работы под ламинаром:
    1. протереть внутреннюю поверхность раствором детергента (или 70-100% спиртом);
    2. поместить под ламинар всё, что потребуется для работы за исключением
    3. а) UV-чувствительных компонентов (обычно ваши клетки),
      б) мусорницы (она слишком грязная для того, чтобы постоянно болтаться под ламинаром, её лучше ставить лишь тогда, когда она действительно нужна);

    4. ~5-10' прожечь UV;
    5. непосредственно работа (вначале сделать всё, что можно без присутствия "грязных" компонентов. Убрать всё ненужное. Внести под ламинар "грязные" компоненты (иногда лучше по очереди);
    6. по окончании работы вновь протереть ламинар раствором детергента (или 70-100% спиртом), выбросить мусор из мусорницы.

    Инструменты и их применение.

    Пинцет, платиновая петля, стеклянный шпатель.

    Стерилизация:

    1. обмакнуть в спирт;
    2. сжечь спирт/прокалить инструмент на пламени горелки*;
    3. охладить**;
    4. (не обязательно) перед использованием шпателя или петли неплохо на всякий случай прикоснуться ими к поверхности агара (петля - ~5'', шпатель - ~30''), чтобы быть уверенным, что они не горячие.

    ________________
    * конечно, можно простерилизовать всю петлю - до пластиковой рукоятки. Но нужно иметь в виду, что массивные металлические части (особенно зажим) остывают медленно и часто разумно ограничиться стерилизацией лишь самой петли (однако, в этом случае и засовывать её в пробирку со средой можно лишь на длину проволочки).
    ** охлаждение металлических инструментов можно ускорить: вновь окунуть раскалённую часть в спирт (но, ВНИМАНИЕ!!!, при этом нужно быть уверенным, что предыдущий спирт действительно выгорел), охладить в нём, а затем быстро пронести над горелкой, лишь бы спирт успел загореться. Спирт сгорит, не успев нагреть инструмент так же сильно, как газовая горелка.

    Зубочистки.

  • Деревянные зубочистки можно стерилизовать как автоклавированием, так и прокаливанием при 120oС. Для выкалывания бактерий можно использовать оба конца (зубочистку держать за середину).
  • Стерильный пинцет.

  • Очень полезный инструмент. Используется для извлечения стерильных зубочисток из стакана, стерильных пипеток из алюминиевого пенала.
  • Стеклянные пипетки.

  • Существенно более дешёвая альтернатива пластиковым. Главный недостаток - нужно очень внимательно следить за тем, чтобы верхний конец пипетки не имел сколов. Сколы могут очень быстро испортить уплотнители у Pipet pump.
  • Стеклянные шарики.

  • Используются для распределения бактерий по 22х22сm2чашкам. После использования собрать, вымыть детергентом, прополоскать, высушить. Стерилизовать прокаливанием (оптом) или автоклавированием (в полипропиленовых 15ml пробирках порциями по 10-15 шариков).
  • Кронцанг.

  • Незаменим при работе с резиновыми пробками.
  • UV.

  • Очень серьёзный стерилизатор. Даже кратковременное (~10-20'') облучение губительно для клеток.
  • Пластиковые чашки Петри.

  • Любая чашка, с которой Вы работаете, должна быть подписана. Чашки подписываются только снизу (со стороны агара). Причину такого выбора проще всего понять сняв одновременно крышки с двух чашек, подписанных сверху.
  • Можно использовать многократно для работы с любыми бактериями. Вымыть, высушить, протереть 70-100% спиртом, поместить открытыми под UV на ~15-30'. Многие (но не все) линии эукариотических клеток так же допускают многократное использование чашек.
  • Пластиковые крышки для бактериальных пробирок.

  • Вымыть, высушить, автоклавировать.
  • Руки.

  • Перед работой помыть, протереть 70% спиртом (100% - сушит кожу). Или одеть перчатки и протирать уже их.
  • Особенности работы с эукариотическими клетками.

  • Лучше пользоваться лабораторным халатом, предназначенным только для клеточного блока.
  • Обязательно использовать сменную обувь, а не ту, в которой ходите по улице.
  • Нужно выделить определённые пипетки и инструменты и не использовать их ни для чего, кроме культуральных работ.
  • Для хранения реактивов и сред использовать либо отдельный холодильник, либо отдельную тумбочку в холодной комнате (их мыть - детергентом, а затем протирать либо спиртом, либо раствором формалина).
  • Опасность "заростов" выше в тёплое время года.
  • Работа с бактериями.

  • С бактериями можно чисто работать "на столе" - без ламинара. Всё, что для этого требуется:
  • - чистое, незахламлённое место (важно вовремя выбрасывать всё, что способно зарасти);
    - отсутствие сквозняков или хлопающих поблизости дверей.

  • Выкалывание бактериальных колоний. Для заражения достаточно один раз обмакнуть зубочистку вначале в колонию, а потом в среду. Если вы очень дотошный человек - после того как вы обмакнули зубочистку в колонию, размажьте налипшие бактерии по стенке пробирки (их видно), затем наклоните пробирку так, чтобы среда дошла до бактериального пятнышка и, действуя той же зубочисткой как скребком, соскоблите пятно в среду.
  • Если предстоит высеять несколько штаммов бактерий с различной устойчивостью к антибиотикам стоит работать с ними по очереди, в порядке возрастания устойчивости (например: вначале высев на среду без антибиотиков, затем только с ампициллином, и в конце - с ампициллин/тетрациклином).
  • Бактериальные чашки Петри.

    Обычно чашка подписывается два раза. Первый раз при заливке:

    (1) среда,
    (2) антибиотики и другие добавки (обычные сокращения - смотри таблицу),
    (3) дата (число и месяц).

    Второй раз при высеве бактерий:

    (4) название плазмиды или библиотеки,
    (5) опять дата.

    среда M9M9 ХлорамфениколCm, Cam
    среда LBLB Смесь антибиотиков "GE"GE
    среда SOBSOB АмпициллинA, Amp.
    среда SOCSOC TetracyclineT, Tet.
    среда NZYNZY IPTGI
    среда YENBYENB X-GalX
    среда 2YT2YT ГлюкозаGlu
    Terrific BrothTB МальтозаM
       ThiamineThi
       CarbenicillinCb
  • Заливка чашек (на чашку диаметром 8см требуется 15-20ml агара):
    1. подписать чашки;
    2. агар довести до кипения и кипятить 0.5-1' (для того, чтобы расплавились маленькие кусочки агара, которые могут при остывании выступать как центры "кристаллизации");
    3. остудить (лучше с покачиванием) до ~50-60oС (банку с такой температурой можно держать в руке 1-2');
    4. если заливается немного чашек:

      * раскапать по чашкам соответствующие антибиотики и добавки (но не X-Gal, так как DMFA быстро растворяет полистирен; его вносить прямо в расплавленный агар сразу после заливки.),
      * заливать чашки "по одной" (вылить 15-20ml агара (на глаз), смешивать 30-60'');

      если заливается много чашек:

      * добавить необходимое количество антибиотиков и добавок прямо в банку, смешать,
      * разлить по чашкам;

    5. после заливки следует оставить чашки на 1.5-2h под работающим ламинаром (или, если ламинара нет - в термостате на 37oС вверх дном, чуть приоткрыв) чтобы агар подсох, иначе (i) после хранения в чашке будет полно влаги, (ii) сложно будет втереть шпателем бактерии (чашка всё время будет мокрой);
    6. замотать парафильмом и хранить перевернув
    7. * чашки без антибиотика - NT, в течении года,
      * чашки с антибиотиком - +4oС, в течении полутора/двух недель;

  • На 8см чашке можно растереть шпателем ~200µl бактериальной суспензии (однако удобнее не превышать 100µl). Растирать нужно только пока поверхность чашки влажная (дальше шпатель начнёт драть агар). Чашки и хранятся, и инкубируются при 37oС вверх дном.
  • Колбы и пробирки.

  • Должны быть подписаны (название плазмиды, дата). Культуру бактерий в пробирке можно хранить в холодной комнате 1-2 месяца. Допустимые количества среды для посуды различной ёмкости (превышать эту ёмкость просто нет смысла, так как из-за плохой аэрации получится даже меньший выход бактерий):
  • 16ml стеклянная пробирка3-5ml
    100ml коническая колба5-25ml
    250ml коническая колба20-100ml
    500ml коническая колба50-200ml
    1l коническая колба100-400ml
    2l коническая колба300-600ml
  • Пробирки устанавливаются в качалке под углом ~45o. Для хорошей аэрации нужно, чтобы крышка колбы позволяла воздуху проникать в колбу.
  • Очень удобно, если у конической колбы в нижней части есть 2-3 вдавливания. В этом случае среда перемешивается и насыщается кислородом значительно эффективнее.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100