на главную страницу
 > Обзоры > ПЦР-стратегии для клонирования мультигенных семейств.

ПЦР-стратегии для клонирования мультигенных семейств.


    Растущий объем баз данных биологических последовательностей делает ПЦР эффективным инструментом для поиска интересующих генов. Для клонирования гомологов из несеквенированных геномов, могут быть использованы следующие стратегии для дизайна праймеров:
    - консенсусные праймеры
    - вырожденные праймеры
    - CODEHOP-праймеры

    Консенсусные праймеры создаются на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей группы генов, например, при помощи программы HYDEN. Однако, используемость (частота встречаемости) кодонов у разных видов отличается и, следовательно, информация по нуклеотидным последовательностям не всегда может быть успешно применена на новом объекте. Близко к использованию консенсусных праймеров стоит "эволюционная ПЦР" (White et al., 1989), когда праймеры, созданные на основе нуклеотидной последовательности одного вида, используются в реакции с ДНК другого вида. Она положительно зарекомендовала себя в кон. 80х - нач. 90х гг. 20 в., когда обширные секвенционные данные не были ещё получены.

    Другой возможностью является создание праймеров на основе аминокислотных последовательностей. В случае белковых семейств работает программа DePict. Вследствие вырожденности генетического кода, одной аминокислотной последовательности может соответствовать одна из множества возможных, её кодирующих. Вырожденный праймер представляет собой смесь нуклеотидных последовательностей, каждая из которых представляет собой индивидуальный праймер. Рекомендуется, чтобы число индивидуальных праймеров в смеси ("степень вырожденности") не превышало 512 [Compton, 1990], иначе эффективность ПЦР падает из-за снижения эффективной концентрации праймера. Если вырожденность выше желаемой, для одной и той же аминокислотной последовательности следует создать несколько вырожденных праймеров ("подпраймеров"). Так, лейцин кодируется 6 кодонами, которые можно разбить на две группы: TTR и CTN. В случае присутствия нескольких лейцинов имеет смысл использовать 2 "подпраймера": один, содержащий кодоны CTN, а другой - TTR. Впрочем, можно использовать в качестве праймера и лишь одну последовательность из возможных. В этом случае, как и в случае "эволюционной ПЦР", праймеры будут приблизительными (mismatched).

    Интереснейший взгляд на конструирование прймеров выражают CODEHOP-праймеры. Они показали высокую эффективность при клонировании представителей мультигенных семейств [Rose et al., 2003]. Мэйнстримом при создании праймеров становится представление о том, что их 3'-конец отвечает за чувствительность (то есть, способность разделять комплементарные и некомплементарные участки матрицы), а 5'-конец придает способность прочно связываться с матрицей [Sommer & Tautz, 1989]. Поэтому CODEHOP-праймеры состоят из участков, разнящихся по степени соответствия матрице и принципу их выведения. Более короткий 3'-участок (11-12 осн.) является полностью вырожденным и представляет все возможные пути кодирования данной аминокислотной последовательности. Более длинный 5'-участок (20-30 осн.) лишь приблизительно представляет кодирующую последовательность, но оказывается достаточным для надежного удержания праймера на матрице. CODEHOP-праймеры строятся на основе выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью программы, доступной интерактивно (http://blocks.fhcrc.org/codehop.html). При их создании используются данные по частоте встречаемости кодонов в различных геномах. Следует учитывать, что эта информация носит усредненный и, чаще, неполный характер и не всегда может быть применена автоматически. Более того, предпочтение кодонов у растений, по-видимому (Chiapello et al., 1998), связано с функцией гена, а не только с видовой принадлежностью. Так, гены "домашнего хозяйства" обогащены G/C-содержащими кодонами, а гены, варьирующие свою активность, - А/Т-содержащими.

     Rose TM, Henikoff JG, Henikoff S. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer) PCR primer design. Nucleic Acids Res. 2003 Jul 1;31(13):3763-6.
     Sommer R, Tautz D. Minimal homology requirements for PCR primers. Nucleic Acids Res. 1989 Aug 25;17(16):6749.
     White TJ, Arnheim N, Erlich HA. The polymerase chain reaction. Trends Genet. 1989 Jun;5(6):185-9.
     Compton T (1990). Degenerate primers for DNA amplification. pp. 39-45 in: PCR Protocols (Innis, Gelfand, Sninsky and White, eds.); Academic Press, New York.
     Chiapello H, Lisacek F, Caboche M, Henaut A. Codon usage and gene function are related in sequences of Arabidopsis thaliana. Gene. 1998 Mar 16;209(1-2):GC1-GC38.




"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100