Уровни компактизации ДНК.

Суммарная длина ДНК 46 хромосом человека составляет 2 метра. Однако вся она упаковывается в ядре клетки и в метафазных клетках степень компактизации достигает 10⁴ раз. Этот доклад посвящён тому, как достигается такое уплотнение и как это отражается на транскрипции генов.

Молекула ДНК представляет собой левую спираль диаметром 2nm. Следующий уровень компактизации - ДНК, накрученная на нуклеосомы диаметром ~ 11nm (компактизация в 6-7 раз). Нуклеосома образована четырьмя белками - гистонами. Между нуклеосомами находиться линкерный гистон, который в состав нуклеосомы не включают. В свою очередь нуклеосомы тоже упаковываются в более плотные структуры диаметром 30nm (уплотнение в 40 раз). Структуры эти тоже имеют левую спиральность. 30nm фибриллы укладываются в петли (уплотнение в 680 раз). Последний уровень компактизации - метафазный гетерохроматин (уплотнение в 10000 раз).

В настоящее время при помощи электронной микроскопии, рентгеноструктурного анализа, методов ЯМР исследована структура коровой (ядерной) части нуклеосомы. Про более высокие уровни укладки известно достаточно мало, зато существует масса моделей. Например, для 30 нм фибрилл существует минимум 4 модели, в каждой из которых нуклеосомы укладываются тем или иным способом:

1. Соленоидная модель. Цепь сворачивается в левую спираль с шестью нуклеосомами на оборот. H1 локализован вдоль длинной оси 30nm структуры, внутри её.
2. Модель суперспирали. Аналогична соленоидной, но H1, возможно, локализован на периферии или между нуклеосомами по всей длине спирали.
3. Кросс - линкерная модель. 10nm филаменты сворачиваются, подобно мехам баяна, в зиг - заговую структуру, вдоль продольной оси в виде двойной суперспирали. Нуклеосомы на периферии структуры, поперёк продольной оси расположены линкерные участки.
4. Ленточная модель. 10nm структура сложена в ленту, которая закручена в суперспираль.

Структура нуклеосомы.

Нуклеосома состоит из 4 пар гистонов, которые образуют её кор (ядро). Две пары димеров H2A-H2B и тетрамер из 2 пар гистонов H3 и H4. Сначала с ДНК ассоциируется тетрамер, а после - два димера. ДНК делает вокруг нуклеосомы 1.75 оборота. При обработке микрококковой нуклеазой можно получить минимальное количество оснований на нуклеосоме - 146. Реально на одну нуклеосому приходиться примерно 180bp. Кроме того, в организацию нуклеосомной последовательности вовлечён гистон H1. Считается, что он ассоциирован с линкерной ДНК. У коровых гистонов выраженая доменная структура: неструктурированный C - конец, центральная глобулярная часть, положительно заряженный N - конец. На N - концах примерно каждый четвёртый остаток лизин или аргинин. Взаимодействуя с ними, отрицательно заряженная ДНК, фиксируется на нуклеосоме. Гистоны могут быть ацетилированы, метилированы, фосфорилированы, ADP - рибозилированы.

Состав хроматина.

Хроматин состоит из примерно одинакового по массе количества ДНК и белка. Половину белков составляют негистоновые белки, например, HMG - белки. (High Mobility Group). Конкретные функции HMG - белков не известны. Предполагается, что они выполняют структурные и регуляторные функции в процессе транскрипции и поддержании определённых структур хроматина.

Ацетилирование гистонов.

30nm структура не всегда гомогенна. В зависимости от состояния транскрипционной активности, структура может сворачиваться и разбираться. Такая мобильность хроматина достигается при помощи действия гистонацетилтрансфераз (HAС) и гистондеацетилтрансфераз (HDAС). HAС ацетилируют N - концы гистонов. Тем самым нейтрализуется избыточный положительный заряд положительно заряженных концов гистонов и ослабляется взаимодействие ДНК с нуклеосомным кором.

В пользу того, что действие HAС направлено на облегчение процесса транскрипции указывает множество фактов. Вот некоторые из них, полученные в экспериментах с дрожжами S.cervisiae.

• HAС не могут ацетилировать специфически мутированный гистон H4. При этом транскрипция уменьшается.
• Ингибирование HDAС приводит к повышению уровня транскрипции.
• Ацетилирование HMG - белков имеет структурное и cis - регуляторное значение.

Один из наиболее известных комплексов, обладающий ацетилтрансферазной активностью - SAGA - комплекс. Один из белков, входящих в состав этого комплекса у дрожжей, Gsn5, является HAC. Однако каким образом осуществляется взаимодействие указанного комплекса с другими комплексами и белками транскрипционной машины до конца не известно.

Другие известные белки, обладающие HAC - активностями:

• TAFII130, TAFII250 - факторы активации транскрипции;
• P300/CBP - HAC, взаимодействует с энхансерами и ассоциирован с РНК - полимеразой II;
• P-CAF;

Про HDAC в настоящее время известно достаточно мало. Одна из наиболее изученных - Rpd3. Предполагается, что она ингибирует действие SAGA - комплекса.

Опираясь на всё рассмотренное, итересно выглядит схема уровня активации хроматина, предложенная Kadonaga.

Состояние активности гена Структура гена Активированное Промотер- и энхансер-связывающиеся факторы с базовой РНК полимеразной машиной находящейся в активированном состоянии на промоторе; In vitro: базовые факторы транскрипции и активаторы.     Истинная активация Дерепрессированное Матрица, доступная транскрипционным факторам; 10nm или слабо уложенная 30nm хроматиновая фибрилла; Возможно, что гистоны удалены; In vitro: голая ДНК с базовыми факторами транскрипции.     Антирепрессия Неактивное базовое. 30nm или 10nm хроматиновая фибрилла репрессированная позиционированными нуклеосомами; Ингибирование негистоновыми репрессорами; In vitro: хроматиновая матрица или голая ДНК с негистоновыми репрессорами.

ATP - зависимые хроматинремоделирующие системы.

Было обнаружено, что в дрожжах ацетилирование гистонов SAGA - комплексами в генах под HO - промоторами происходит при участии комплекса SWI/SNF. Этот комплекс взаимодействует с сигнальной молекулой Swi5, которая, узнав и связавшись со специфическим местом на ДНК, становиться способной провзаимодействовать с SWI/SNF. После этого активность комплекса SAGA направлена на ацетилирование коровых гистонов, находящихся рядом с Swi5 и SWI/SNF. При этом Swi5 перестаёт быть связанной с хроматином.

SWI/SNF обладает ATP - азной активностью. Однако известны примеры, когда транскрипция наблюдается без одной из активностей: либо ацетилазной, либо ATP - азной.

ATP - зависимая активность рассматриваемых комплексов направлена на изменение структуры хроматина - изменение структуры укладки нуклеосом для создания условий работы РНК - полимеразы II.

Известно множество комплексов, способных изменять структуру нуклеосом. Например, в дрожжах SWI/SNF, RSC, ISW1, ISW2; у человека: hSWI/SNF, NURD, RSF; у дрозофилы: dSWI/SNF, NURF, CHRAC, ACF. Все они в основе своей имеют субъединицу, обладающую ATP - зависимой активностью. Таких субъединиц всего две и они гомологичны от комплека к комплексу. В следующей таблице приведены некоторые свойства комплексов на основе двух указанных субъединиц.

Активное состояние хроматина.

После того, как произошло ремоделирование структуры хроматина HAC, SWI/SNF, ISWI комплексами, наступает время работы РНК - полимеразы II. Существует несколько моделей того, как это происходит:

1. На первом этапе с зарепрессированным хроматином связываются активаторы, которые способствуют работе над всей последовательностью гена ремоделирующих комплексов, которые, в свою очередь, делают ДНК доступной для работы РНК - полимеразы II.
2. С зарепрессированным хроматином связываются активаторы. После этого вдоль последовательности гена проходит "первичная" РНК - полимераза, которая тащит на себе всё необходимое для ремоделирования хроматина. При этом полимераза транскрибирует ген. Имеются экспериментальные данные, указывающие на то, что первичный транскрипт отличается от последующих транскриптов с данного гена в данном активном состоянии. Вслед за "первичной" полимеразой начинает работать РНК - полимераза II, которая движется уже по ремоделированному хроматину вдоль последовательности гена.