Дискриминация аллельных вариантов на твёрдой фазе

Большинство способов детекции сложно применять одновременно к нескольким локусам. Если бы определение и визуализация шли в одной пробирке сразу для нескольких SNP, это позволило бы значительно ускорить и упростить анализ.

Микроматрица - это твердый носитель небольшого размера (например, стекло, нейлон или металлическая пластинка) с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами (8-80нп) или фрагментами ДНК (размером более 100нп). Прикрепление одного из компонентов реакции к подложке позволяет проводить множество реакций в параллель пространственно разделив детекцию отдельных SNPs. Иммобилизованной может быть как ДНК с известной последовательностью (контрольная ДНК), так и анализируемая ДНК, с неизвестным нуклеотидом в позиции SNP. Микроматрицы могут применяться как для мутационного скрининга, так и для детекции известных аллелей (Hacia and Collins 1999). Иммобилизованная ДНК может просто гибридизоваться с неизвестной последовательностью, и тогда степень гибридизации служит сигналом наличия/отсутствия мутации, либо присутствующая в растворе ДНК может являться матрицей для синтеза ДНК с иммобилизованного праймера для определения прилежащего к нему нуклеотида.

Олигонуклеотидные микроматрицы для гибридизационного анализа

Гибридизация на олигонуклетидных микроматрицах активно разрабатывалась в 80е годы, когда делались попытки создать метод секвенирования ДНК, основанный на гибридизации секвенируемой последовательности с универсальным набором олигонуклеотидов (гекса- или октамеров) (Lysov et al. 1988; Southern et al. 1992). Метод не получил распространения, т.к. подходил только для секвенирования коротких фрагментов. Однако заложенный в него принцип годится для сравнения друг с другом фрагментов умеренной длины. Показано, что эффективность гибридизации сильно зависит от нуклеотидной последовательности и вторичной структуры ДНК. Сила сигнала изменяется даже если зонд и проба различаются на один нуклеотид, что дает возможность детектировать SNP с помощью микроматриц.

В случае поиска еще неизвестных SNP применяется VDA (variant detector array), когда иммобилизуются олигонуклеотиды, содержащие в каждой позиции любой из четырех dNTPs (Sapolsky et al. 1999). Олигонуклеотид, полностью комплементарный флуресцентно-меченому зонду, даст более сильный сигнал, чем остальные три, отличающиеся от него в SNP-позиции (Puc. 9). Использование этой технологии позволило провести поиск SNP на участке геномной ДНК размером 2Мb, содержащем порядка 16000 STS-маркеров. 90% результатов подтвердилось последующим секвенированием исследуемой ДНК (Wang et al.1998).

Рис. 9. Cравнение геномных последовательностей A/J и C57BL/6J линий мыши на олигонуклеотидной микроматрице (в представленной SNP позиции - основание C у C57BL/6J и G у A/J). Каждая позиция сиквенса тестировалась 25 членным олигонуклеотидом, 13 позиция которого имела 4 варианта оснований: A,G,C,T (Lindblad-Toh K et al. 2000).

Ситуация значительно упрощается при скринировании уже известных SNP, т.к. в каждом случае нужны только те олигонуклеотиды, которые соответствуют известным аллельным вариантам. Такие аллель-специфические наборы олигонуклеотидов были использованы для генотипирования однонуклеотидных замен в гене CFTR (Cronin et al. 1996), человеческом гене тирозиназы (Guo et al. 1994), гене цитохрома Р450 (Cronin et al. 1998), генах обратной транскриптазы и протеазы HIV (Kozal et al. 1996), гене BRCA1 (Hacia et al. 1996) и в мтДНК человека (Chee et al. 1996). Для повышения чувствительности и специфичности используется двуцветный анализ, когда в реакцию добавляется по-другому меченый нормирующий зонд. Этот подход использовался при характеристике изменений в кодирующей области генов ATM (Hacia et al. 1998), BRCA1 (Hacia et al. 1996), и протяженных участков мтДНК (Chee et al. 1996).

Развитие микроматриц идет в сторону увеличения количества и плотности расположения олигонуклеотидов на носителе (Okamoto et al. 2000). Параллельно исследователи пытаются повысить чувствительность и специфичность гибридизации.

Несмотря на впечатляющие результаты, этот метод требует большого количества материала и плох для детекции небольшого числа мутантных аллелей при большом фоне аллелей дикого типа.

Минисеквенирование

Многие проблемы предыдущего подхода можно обойти, используя реакцию минисеквенирования. Гибридизующийся зонд в этом случае используется в качестве матрицы для синтеза ДНК с иммобилизованного олигонуклеотида. Вместо dNTP, можно добавлять в реакцию меченые ddNTP одновременно для терминации реакции синтеза и мечения получающегося продукта. Таким образом можно получить информацию о следующем за праймером нуклеотиде, соответствующем позиции SNP (Nikiforov et al. 1994). В отличие от чипов, используемых для гибридизационного анализа (the Affymetrixв chip; Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), в этом случае олигонуклеотиды иммобилизуются на поверхности за 5' конец, оставляя 3'конец свободным для элонгации. Существует множество вариаций этой методики и сама реакция может заключаться как в непосредственной элонгации праймера (если праймер лежит вплотную к SNP, (Puc.10)) (Syvanen 1999), так и в элонгации, определяемой праймером (если 3' нуклеотид праймера соответствует одному из аллельных состояний SNP и элонгация праймера зависит от того, комплементарен этот нуклеотид матрице или нет) (Sokolov 1990). Кроме минисеквенирования на твердой фазе, существуют и другие способы детекции продуктов реакции минисеквенирования, например ELISA, или разделение в геле (Pastinenet al. 1996; Sokolov 1990).

Рис. 10. Схема аллель-специфического удлинения праймеров, иммобилизованных на матрице. (Pastinen et al. 2000).

В качестве иммобилизованной на микроматрице ДНК используются как синтезированные олигонуклеотиды, так и ПЦР-продукты (Nikiforov et al. 1994; Syvanen et al. 1992). Связь с подложкой может осуществляться например, за счет посадки биотинилированных фрагментов на стептавидиновые частицы (Syvanen et al. 1992), или за счет образования ковалентных связей с дисульфидными группами на 5'конце олигонуклеотида (Nikiforov et al. 1994, Pastinen et al. 1997). ddNTP можно метить флуоресцентными красителями, биотином (если только его уже не использовали для пришивки олигонуклеотида к матрице) или гаптенами, которые можно детектировать с помощью конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой антител в формате ELISA. Для успешного широкомасштабного генотипирования кроме создания микроматрицы, требуется наладить еще и проведение надежного множественного ПЦР.

Интересным и перспективным методом сиквенса на твёрдой фазе является пиросиквенс - сиквенс сопряжённый с синтезом. Используя в качестве субстрата отщепляемый при синтезе пирофосфат каскад ферментативных реакций генерирует детектируемый свет количество которого пропорционально количеству включенных нуклеотидов. Описана система детекции SNP анализирующая 96 образцов за 5 минут (Ahmadian et al. 2000).

Оптиковолоконный ДНК гибридизационный анализ

Использование в качестве твердых подложек для посадки олигонуклеотидов оптических волокон вместо предметных стекол обеспечивает более надежную регистрацию как возбуждающего, так и исходящего излучения (Walt 2000). Оптиковолоконная детекторная система, способная одновременно регистрировать несколько гибридизаций была успешно использована для генотипирования онкoгена H-Ras (Healey et al. 1997).

Хроматографические методы дискриминации аллельных вариантов

Некоторые способы детекции мутаций (CGGE - constant gradient gel electrophoresis, DGGE - denaturating gradient gel electrophoresis, TGGE - temperature gradient gel electrophoresis) основаны на различиях в температуре плавления фрагментов ДНК с различной нуклеотидной последовательностью. Содержащий мутацию фрагмент обнаруживается по изменённой электрофоретической подвижности (Puc. 11, 12). ПЦР-продукты частично денатурируют формамидом, мочевиной (CGGE, DGGE) или температурой (TGGE), а затем разделяются в равномерном (CGGE) или градиентном (DGGE) денатурирующем геле. В некоторых случаях, для увеличения разницы в температуре плавления ПЦР-продуктов, к ним лигируют залипающие сами на себя праймеры. Частично денатурированные теплом ПЦР-продукты можно разделять не только электрофоретически, но и методом DHPLC (denaturating high-performance liquid chromatography) (Huber et al. 1993). Этот метод также позволяет детектировать полиморфные участки ДНК, в частности, удалось выявить гомо- и гетерозиготные состояния последовательностей в генах CFTR, RET и PTEN (Liu et al. 1998), BRCA1 (Arnold et al. 1999). Анализ методом DHPLC хорошо автоматизируется. Кроме того, он экономичен по времени (анализ одного образца занимает порядка 5 минут), результаты легко интерпретировать, а длина доступных для анализа фрагментов составляет порядка 1,5 kb.

Рис. 11. Схема, поясняющая принцип действия перпендикулярного градиента в DGGE. При низких концентрациях денатуранта фрагменты обоих типов (дикий и мутантный) двухцепочечные, при повышении концентрации они начинают плавиться, при слишком высоких могут стать полностью одноцепочечными (BIO-RAD Laboratories).

Рис. 12. Примеры анализа. (A) перпендикулярный DGG; (B) параллельный DGG (на дорожках - дикий тип, мутант и гетерозигота) (BIO-RAD Laboratories).

Физические методы детекции SNP

Масс-спектрометрическое секвенирование

Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд (Graber et al. 1999). На примере гена ТР53 было показано, что метод очень чувствителен, достоверно детектирует гомо- и гетерозиготы и позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких образцов одновременно (Griffin et al. 1999; Jackson et al. 2000; Li et al. 1999). Ионизированные молекулы ДНК отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) и ESI (electrospray ionisation) (Griffin et al. 1999). Они разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) - уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца (Little et al. 1997; Graber et al. 1999).

Масс-спектрометрический анализ успешно применяется для визуализации результатов детекции SNP другими методами, например минисеквенированием или инвазивным расщеплением.

Резонансный перенос энергии флуоресценции

Резонансный перенос энергии флуоресценции - ещё одно физическое явление, активно использующееся для SNP анализа. Оно позволяет следить за состоянием молекулы зонда в пробирке оптическими методами, непосредственно в ходе реакции. Принцип явления заключается в том, что если два флуорофора расположены в непосредственной близости друг от друга (в большинстве реализаций метода - на одном олигонуклеотиде) и спектр испускания первого совпадает со спектром поглощения второго (тушителя), то при возбуждении первого вместо флуоресценции будет происходить передача энергии на тушитель. При увеличении расстояния между флуорофором и тушителем (например, если какой либо из флуорофоров отщепляется от олигонуклеотида) флуоресценция восстанавливается.

Наиболее широко используется резонансное тушение флуоресценции в TaqMan системе, позволяющей контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции (Heid et al. 1996). Для детекции используется не способный удлиняться зонд, несущий флуорофор и тушитель и комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq полимераза разрушает его в ходе ПЦР реакции за счёт экзонуклеазной активности, сопряжённой с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от тушителя. Используя два аллель-специфических зонда с различными флуоресцентными метками можно надёжно различать гомо и гетерозиготы (Livak 1999) (Puc. 13, 14).

Рис. 13. Аллельная дискриминация с помощью 5' нуклеазного (TaqMan) анализа. Присутствие мисматча оказывает влияние на эффективность расщепления зонда (Livak 1999).

Рис. 14. Аллельная дискриминация с помощью 5' нуклеазного (TaqMan) анализа. Представлены величины конечной флуоресценции для 43 независимых анализов (Livak 1999).

В методе минисеквенирования для детекции связавшихся меченых ddNTPs можно использовать систему FRET (fluorescence resonance energy transfer). Включенные при элонгации флуоресцентно-меченые ddNTP получают энергию от FITC расположенного на 5' конце праймера. Для детекции используется TaqManв system(ABI 700) (Chen and Kwok 1999). Другой способ зарегистрировать точечные мутации в одной пробирке - это гибридизовать несущий мутацию фрагмент ДНК с одноцепочечными олигонуклеотидами, которые становятся флуоресцентными, когда связываются с полностью комплементарными молекулами (Marras et al. 1999). Такие олигонуклеотиды (molecular beacons) сами по себе имеют структуру шпильки, при этом флуорофор и тушитель на концах шпильки оказываются близко друг от друга. Шпилька разрушается при гибридизации molecular beacon с комплементарным фрагментом ДНК. Количество SNP, одновременно детектируемых таким способом, зависит от количества используемых флуорофоров и качества molecular beacons (эффективности тушения в неактивном состоянии).

Флуоресценция, зависящая от локального окружения

Использование в качестве репортерного флуорофора terbium chelate (Nurmi 2000) позволяет проводить TaqMan подобный анализ без использования тушитель, так как флуоресценция terbium chelate зависит от локального окружения и гораздо слабее в ассоциации с одноцепочечной ДНК, чем в растворе.

Список литературы