Инвазивное расщепление олигонуклеотидного зонда

Среди эндонуклеаз, используемых для обнаружения мутаций - Flap-эндонуклеазы, узнающие заходящие друг на друга участки ДНК (Lyamichev et al. 1999) (Puc. 4). Эти ферменты участвуют в репарации и репликации ДНК, удаляя смещенную во время репликации цепь. Для детекции SNP два олигонуклеотида (инвазивный (Invader) и сигнальный (Probe 1)) гибридизуются с анализируемой ДНК строго друг за другом. Удаление некомплементарного сигнального участка олигонуклеотида (Probe 1) происходит лишь в том случае, если нуклеотид (выделен красным), перекрытый инвазивным олигонуклеотидом, комплементарен матрице. Использование термостабильных Flap-эндонуклеаз позволяет проводить реакцию при температуре, близкой к температуре отжига олигонуклеотидов, что обеспечивает возможность многократной гибридизации-денатурации и, соответственно, амплификации сигнала. Такой подход весьма чувствителен и позволяет различать гомо- и гетерозиготы без амплификации непосредственно на геномной ДНК.

Рис. 4. Схема амплификации сигнала с помощью двойной реакции Invader (Hall et al. 1999).

Лигазная детекция

Метод основан на высокой чувствительности к субстрату лигаз из термофильных организмов: они не способны сшивать ник, если фланкирующие нуклеотиды некомплементарны матрице. Как правило, 3'-концевые мисматчи лучше дискриминируются, чем 5'-концевые. В реакции лигазной детекции (LDR, Ligase detection Reaction) используются три олигонуклеотида, два из которых флуресцентно меченые аллель-специфические (различаются только меткой и 3'-нуклеотидом, соответствующим позиции SNP), а третий располагается с 5' стороны от SNP и непосредственно примыкает к аллель-специфическому праймеру. Полученные лигированные фрагменты детектируются с помощью электрофореза. Использование термостабильных лигаз позволяет увеличить выход реакции за счет проведения нескольких циклов денатурации/лигирования (Favis et al. 2000).

Рис. 5. Схема лигазной цепной реакции.

В других схемах амплификация лигазной реакции достигается: (i) за счет использования олигонуклеотидов, комплементарных обеим цепям, так что каждый цикл лигирования сопровождается двукратным увеличением количества матрицы (LCR, ligase chain reaction) (Puc. 5); (ii) сочетанием методов LDR и ПЦР (более подробно метод описан ниже) (Barany et al. 2001); (iii) использованием зонда, замыкающегося в кольцо при лигировании (padlock probe) и последующим синтезом ДНК на зонде по механизму катящегося колеса (Lizardi et al. 1998.) (Puc. 6). Избирательность LCR реакции при детекции транзиций может быть значительно повышена, если олигонуклеотиды не перекрывают позицию SNP, а примыкают к ней. При этом для заполнения разрыва используется KlenTaq полимераза с соответствующими аллелю дезоксинуклеотидами (либо A и T, либо G и C) (Abravaya et al. 1995).

Рис. 6. Схема амплификации по механизму катящегося колеса. (a) лигирование после заполнения разрыва c помощью олигонуклеотида или полимеразы; (b) гибридизация с padlock-специфическим праймером; (c) амплификации синтезом ДНК на кольцевом зонде по механизму катящегося колеса (Lizardi et al. 1998).

Множество способов детекции и обнаружения SNP основаны на различных модификациях ПЦР.

Прямая терминация ПЦР

ПЦР проводится по стандартной схеме, но один из dNTP берётся в лимитирующей реакцию концентрации (Chen and Hebert 1998) (Puc. 7). Это приводит к тому, что после нескольких циклов синтез ДНК обрывается в позициях, соответствующих лимитирующему нуклеотиду. В результате, с каждого праймера синтезируется набор фрагментов разной длины. Реакция напоминает секвенирование или секвенирование во время ПЦР. Долю недосинтезированных фрагментов по отношению к полноразмерным можно увеличить при использовании ³⁵S-меченого аналога лимитирующего dNTP. Это плохой субстрат для полимеразы, поэтому меченые ³⁵S-dNTP будут встраиваться в последнюю очередь, когда немеченые уже израсходуются. Получившиеся продукты разгоняются в денатурирующих условиях. Метод прост в исполнении и более нагляден, чем SSCP, но для детекции SNP не очень удобен, т.к. требует подбора условий ПЦР для каждого локуса.

Рис. 7. Детекция с помощью DT-PCR изменений последовательности 37 независимых A.nebulosus (Chen and Hebert 1998).

Аллель-специфическая ПЦР

Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией SNP (Kwok et al. 1990.). Степень дискриминации мисматчей можно повысить вводя дополнительный, неспаренный нуклеотид во второй или третей позиции с 3' конца этого же праймера. Ещё один способ повышения специфичности - проведение в той же пробирке конкурирующей ПЦР реакции (Zhu et al. 1996; Sasvari-Szekely et al. 2000). К сожалению, хуже всего различаются мисматчи типа G:T, которые соответствуют наиболее часто встречающемуся типу SNPs - транзициям C<=>T (G<=>A).

Химические методы

Достоинством химического расщепления (Cotton 1999) является практически 100% узнавание всех типов гетеродуплексов. В настоящее время на это не способен ни один ферментативный метод. Кроме того, возможно локализация и идентификация мутаций. Недостаток - достаточно сложная процедура и токсичные реактивы.

Ещё один способ химической детекции SNPs - зависящий от структуры дуплекса гидролиз сильно флуоресцирующего acridinium ester в слабощелочных условиях (проходит эффективнее, если флуорофор находится в непосредственной близости от мисматча) (Nelson et al. 1996). Детектируется исчезновение флуоресценции после гидролиза.

Было описано химическое лигирование, способное эффективно различать как 5', так и 3' концевые мисматчи (Xu and Kool 1999).

Дискриминация аллельных вариантов электрофорезом

SSCP (single strand conformation polymorphism) и анализ гетеродуплексов первыми начали применяться для обнаружения полиморфных участков ДНК. Благодаря простоте и относительно высокой чувствительности эти методы постоянно модернизируются и широко используются и в настоящее время (Nataraj et al. 1999).

Полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК

Традиционный SSCP анализ включает денатурацию ПЦР-продуктов и разделение их в неденатурирующем геле (Puc. 8). Электрофоретическая подвижность одноцепо-чечных фрагментов зависит в этом случае от их нуклеотидной последовательности, определя-ющей характер вторичных и третичных структур, и меняется даже при отличии в один нуклеотид. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов.

Рис. 8. SSCP генотипирование 10 cDNA локусов. Представлены генотипы двух P₁ родителей, двух F₁ родителей и 9 F₂ потомков. (Fulton et al. 2001).

Анализ гетеродуплексов

В этом случае денатурированные тестерный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют дуплексы. Если последовательности двух цепей полностью комплементарны, то будут образовываться гомодуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид - гетеродуплексы. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность и могут быть разделены в неденатурирующем геле. В лабораторных исследованиях меченые Су-5 ПЦР-продукты с известным нуклеотидом в позиции SNP смешиваются с анализируемыми ПЦР-продуктами (Arguello et al. 1998).

Модифицированный сиквенс

Несомненно, самый точный метод детекции - прямой секвенс интересующего участка генома. Но это дорого и неудобно при анализе множества SNP. Предложено несколько модификаций сиквенсовой реакции, снижающих её стоимость. Например, можно секвенировать сразу обе цепи в одной реакции используя два различно меченых праймера (Plaschke et al. 1998). Другой способ - использование SSR (single sequencing reaction), когда для терминации синтеза используется только один из четырех ddNTP (Kristensen et al. 1998). Активно разрабатываются способы совмещения PCR-амплификации и секвенирования в одной пробирке сразу для нескольких локусов (Kilger and Paabo 1997; Ruano and Kidd 1991; Yager et al. 1999).