на главную страницу
 > Обзоры > DPE промотор.

DPE промотор.

DPE представляет собой отдельный класс промоторов, способных осуществлять как базальную, так и активируемую транскрипцию. В настоящее время существует модель взаимодействия TFIID с DPE промотором.

Екатерина Муравьёва, Институт Биологии Гена.

    У Drosophila melanogaster существует большая группа промоторов, не содержащих ТАТА бокса. К ним относятся как промоторы генов, кодирующих белки, так и промоторы транспозонов без длинных концевых повторов. Было замечено, что для осуществления транскрипции с таких промоторов необходима область от +1 до +40 от старта инициации транскрипции. Она была названа DPE (Downstream Promoter Element).

    Изучение DPE промоторов проводилось лишь в одной лаборатории под руководством James T. Kadonaga. На сегодняшний день вышло 5 статей по этой теме.

    В изучении DPE промоторов большую роль сыграли два метода: определение связывания с промоторной областью TFIID методом футпринт-анализа и in vitro транскрипция.

    Первоначально для промоторов четырёх генов (AntpP2, joc, Ubx, E74) было показано, что TFIID защищает при футпринтинге область от +1 до + 40. Затем перечень промоторов, с downstream областью которых происходит связывание TFIID был расширен: 297, brown, caudal, Doc, E74A, E74B, engrailed, G, glass, I, singed. Связывается именно комплекс TFIID. TBP отдельно связываться с этими промоторами не способен. На основании этого, сравнительно небольшого числа промоторов, был определен консенсусный мотив связывания TFIID: {(A/G)G(A/T)CGTG} находящийся в положении от +28 до +34. Мутации в консенсусном сайте оказывались критичными как для связывания TFIID, так и для in vitro транскрипции, тогда как мутации в окружающих районах не имели cущественного значения. Была проверена теоретическая возможность, что эта последовательность может оказывать влияние не на уровень транскрипции, а на стабильность РНК, но стабильность транскриптов, содержащих нативный и мутантный консенсус, оказалась одинаковой.

    Существует группа промоторов(white, labial, Stellate, E75A), в которой консенсус похож, но не вполне соответствует установленному ранее, однако нуклеотиды в соответствующих положениях оказываются функционально значимыми (для связывания TFIID и in vitro транскрипции). Изменения, приближающие сайт к консенсусному, значительно увеличивают эффективность транскрипции. По-видимому, ослабленный промотор - это один из способов регуляции активности этих генов.

    Для поиска более точной обобщенной последовательности DPE промотора использовали два метода: создание случайных библиотек (отдельные нуклеотиды внутри промотора были рандомизированы, и последовательность промоторов со значительным уровнем транскрипции определялась секвенированием) и анализ баз данных промоторов (в рассмотрение принимались только те промоторы, старт начала транскрипции которых точно определен молекулярными методами). Все промоторы дрозофилы удалось разделить на четыре группы: (i) ТАТА-содержащие; (ii) DPE-содержащие; (iii) содержащие и ТАТА и DPE; (iv) не содержащие ни ТАТА ни DPE. Был определен более общая консенсусная последовательность для DPE промоторов {(A/G/T)(C/G)(A/T)(C/T)(A/C/G)(C/T)} и показана важность нуклеотида G в положении +24 (вне области DPE консенсуса).

    Оказалось, что для работы DPE промотора критично наличие интактного инициаторного элемента (Inr). Мутации в этом элементе приводили к снижению связывания TFIID и in vitro транскрипции. То есть, в DPE промоторе, в отличии от ТАТА промотора, DPE последовательность и Inr действуют совместно. Оказалось также, что инициаторный элемент гораздо консервативнее в DPE промоторах, чем в ТАТА промоторах.

    Эффективность работы DPE промотора сильно зависит от расстояния между инициаторным элементом и DPE консенсусом. Показано, что в промоторе joc увеличение или уменьшение на 3 нуклеотида, а в промоторе G на 1 нуклеотид резко снижают связывание TFIID и in vitro транскрипцию.

    Эксперименты по фото-кросс-сшивке позволили выявить те белковые факторы в составе TFIID, которые непосредственно контактируют с DPE промотором (на модели joc). Это TAF60 и TAF40, гистоноподобные белки (Н4 и Н3, соответственно) присутствующие в TFIID в составе гетеротетрамера. Кроме того, с промотором AntpP2 в минорном количестве связывается TAF30 (Н2В подобный белок). Надо отметить, что в этом случае гистоноподобные белки способны связываться с ДНК сиквенс-специфически.

    Следующим шагом было исследование консервативности DPE промоторов в эволюции. Оказалось, что ядерный экстракт HeLa способен поддерживать базальную транскрипцию с DPE промоторов дрозофилы, то есть содержит белковый аппарат для DPE зависимой транскрипции. Важные свойства DPE промотора дрозофилы (консенсус, инициаторный консенсус и расстояние до инициатора) оказывались настолько же критичными для DPE транскрипции у млекопитающих. Модельным объектом DPE промотора у млекопитающих стал ген IRF-1 мыши и человека, имеющий DPE консенсус. Он проявлял те же свойства, что и DPE промоторы дрозофилы, был способен транскрибироваться эмбриональным экстрактом дрозофилы и транскрибировался in vivo в клеточной культуре эритролейкемии человека К562. Количество DPE промоторов у млекопитающих оценить достаточно сложно, потому что консенсус может быть плохо выражен, как и консенсус инициатора.

    DPE способен обеспечивать базальную транскрипцию, и, кроме того, способен компенсировать отсутствие ТАТА бокса, что было установлено в экспериментах с синтетическим промотором, содержащим и TATA (от hbP2) и DPE (AntpP2), в котором мутировали один из этих элементов или оба. Однако в природном hsp70 промоторе (содержащем оба промоторных элемента) DPE не был способен компенсировать отсутствие ТАТА бокса(?). Также надо отметить, что в присутствии ТАТА, DPE почти не вносит вклада в уровень базальной транскрипции, то есть в присутствии ТАТА DPE промотор не является функциональным.

    DPE промотор способен осуществлять не только базальную, но и активированную транскрипцию. Из высокосолевых ядерных экстрактов был выделен белковый фактор из двух субъединиц с мол. массой 43 и 22 kDa, являющийся активатором DPE промотора. Белок гомологичен Bur6 дрожжей и NC2 человека, для которого в предшествующих исследованиях было показано, что он является репрессором ТАТА направляемой транскрипции (действует через TBP). Белок, выделенный из дрозофилы также оказался не только активатором DPE транскрипции, но также и репрессором ТАТА транскрипции. Делеционный анализ показал, что за активацию и за репрессию ответственны различные части белка. Активация происходит на стадии образования преинициаторного комплекса. Точные мишени неизвестны, но для человеческого гомолога известно, что он взаимодействует с гиперфосфорилированным С-концом РНК полимеразы II. То есть механизм участия одних и тех же регуляторных факторов в ТАТА и DPE направляемой транскрипции может различаться.



    Литература:

    Willy PJ, Kobayashi R, Kadonaga JT. (2000) A basal transcription factor that activates or represses transcription. Science. Nov 3;290(5493):982-5.
    Section of Molecular Biology and Center for Molecular Genetics, University of California, San Diego, La Jolla, CA 92093-0347, USA.

    We have identified an activity that is required for transcription of downstream promoter element (DPE)-containing core promoters in vitro. The purified factor was found to be the Drosophila homolog of the transcriptional repressor known as NC2 or Dr1-Drap1. Purified recombinant dNC2 activates DPE-driven promoters and represses TATA-driven promoters. A mutant version of dNC2 can activate DPE promoters but is unable to repress TATA promoters. Thus, the activation and repression functions are distinct. These studies reveal that NC2 (Dr1-Drap1) is a bifunctional basal transcription factor that differentially regulates gene transcription through DPE or TATA box.


    Kutach AK, Kadonaga JT. (2000) The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. Jul;20(13):4754-64.
    Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California, San Diego, La Jolla 92093-0347, USA.

    The downstream promoter element (DPE) functions cooperatively with the initiator (Inr) for the binding of TFIID in the transcription of core promoters in the absence of a TATA box. We examined the properties of sequences that can function as a DPE as well as the range of promoters that use the DPE as a core promoter element. By using an in vitro transcription assay, we identified 17 new DPE-dependent promoters and found that all possessed identical spacing between the Inr and DPE. Moreover, mutational analysis indicated that the insertion or deletion of a single nucleotide between the Inr and DPE causes a reduction in transcriptional activity and TFIID binding. To explore the range of sequences that can function as a DPE, we constructed and analyzed randomized promoter libraries. These experiments yielded the DPE functional range set, which represents sequences that contribute to or are compatible with DPE function. We then analyzed the DPE functional range set in conjunction with a Drosophila core promoter database that we compiled from 205 promoters with accurately mapped start sites. Somewhat surprisingly, the DPE sequence motif is as common as the TATA box in Drosophila promoters. There is, in addition, a striking adherence of Inr sequences to the Inr consensus in DPE-containing promoters relative to DPE-less promoters. Furthermore, statistical and biochemical analyses indicated that a G nucleotide between the Inr and DPE contributes to transcription from DPE-containing promoters. Thus, these data reveal that the DPE exhibits a strict spacing requirement yet some sequence flexibility and appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila.


    Burke TW, Willy PJ, Kutach AK, Butler JE, Kadonaga JT. (1998) The DPE, a conserved downstream core promoter element that is functionally analogous to the TATA box. Cold Spring Harb Symp Quant Biol.; 63:75-82. Review.
    Department of Biology, University of California, San Diego, La Jolla 92093-0347, USA.

    Burke TW, Kadonaga JT. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. Nov 15;11(22):3020-31.
    Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California, San Diego, La Jolla, California 92093-0347 USA.

    We analyzed the function of the downstream promoter element (DPE), a distinct 7-nucleotide core promoter element that is approximately 30 nucleotides downstream of the transcription start site of many TATA-box-deficient (TATA-less) promoters in Drosophila. There is a strict requirement for spacing between the Inr and DPE motifs, as an increase or decrease of 3 nucleotides in the distance between the Inr and DPE causes a seven- to eightfold reduction in transcription as well as a significant reduction in the binding of purified TFIID. These results suggest a specific and somewhat rigid interaction of TFIID with the Inr and DPE sequences. Photo-cross-linking analysis of purified TFIID with a TATA-less DPE-containing promoter revealed specific cross-linking of dTAFII60 and dTAFII40 to the DPE, with a higher efficiency of cross-linking to dTAFII60 than to dTAFII40. These data, combined with the previously well-characterized interactions between the two TAFs and their homology to histones H4 and H3, suggest that a dTAFII60-dTAFII40 heterotetramer binds to the DPE. Human and Drosophila transcription factors exhibit essentially the same requirements for DPE sequence and for Inr-DPE spacing. In addition, the TATA-less promoter of the human interferon regulatory factor-1 (IRF-1) gene contains a DPE that is important for transcriptional activity both in vitro and in cultured cells. Hence, these studies provide evidence for a direct role of TAFs in basal transcription of TATA-less DPE-containing genes and collectively indicate that the DPE is, in many respects, a downstream counterpart to the TATA box that is present in Drosophila to humans.


    Burke TW, Kadonaga JT. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. Mar 15;10(6):711-24. Department of Biology and Center for Molecular Genetics, University of California at San Diego, La Jolla, 92093-0347, USA.

    We describe the identification and characterization of a conserved downstream basal promoter element that is present in a subset of Drosophila TATA-box-deficient (TATA-less) promoters by using purified, epitope-tagged TFIID complex (eTFIID) from embryos of transgenic Drosophila. DNase I footprinting of the binding of eTFIID to TATA-less promoters revealed that the factor protected a region that extended from the initiation site sequence (about +1) to approximately 35 nucleotides downstream of the RNA start site. In contrast, there was no apparent upstream DNase I protection or hypersensitivity induced by eTFIID in the -25 to -30 region at which TATA motifs are typically located. Further studies revealed a conserved sequence motif, (A/G)G(A/T)CGTG, termed the downstream promoter element (DPE), which is located approximately 30 nucleotides downstream of the RNA start site of many TATA-less promoters. DNase I footprinting and in vitro transcription experiments revealed that a DPE in its normal downstream location is necessary for transcription of DPE-containing TATA-less promoters and can compensate for the disruption of an upstream TATA box of a TATA-containing promoter. Moreover, a systematic mutational analysis of DNA sequences that encompass the DPE confirmed the importance of the consensus DPE sequence motif for basal transcription and further supports the postulate that the DPE is a distinct, downstream basal promoter element. These results suggest that the DPE acts in conjunction with the initiation site sequence to provide a binding site for TFIID in the absence of a TATA box to mediate transcription of TATA-less promoters.



"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100