на главную страницу
 > Обзоры > Инициация транскрипции.

Инициация транскрипции РНК полимеразой II.

Мария Ермолаева, Институт Биологии Гена.

    Какие бывают РНК полимеразы. За что они отвечают. Как устроен промотор класса II.

    У эукариот есть три различные РНК полимеразы - I, II и III, представляющие собой мультибелковые комплексы и ответственные за транскрипцию с соответствующих промоторов: класс I (гены, кодирующие рибосомальные РНК), II (гены, кодирующие матричные РНК и некоторые малые ядерные РНК) и III (гены, кодирующие транспортные РНК и оставшиеся малые ядерные РНК).

    Эукариотические РНК полимеразы не способны сами по себе инициировать транскрипцию. Для этого им необходимы вспомогательные белки - факторы инициации, формирующие совместно с полимеразами преинициаторные комплексы.

    РНК полимераза II узнаёт промоторы класса II. Промотор класса II можно разделить на базальный (коровый), проксимальный и дистальный элементы.

    Классический базальный элемент промотора класса II содержит (i) ТАТА-бокс - последовательность, лишённую GC пар расположенную приблизительно за 25 пар оснований от участка старта транскрипции, и (ii) инициаторный элемент - специфическую нуклеотидную последовательность, находящуюся в районе старта. Существуют неканонические промоторы класса II, не содержащие ТАТА или инициатора.

    Проксимальные элементы располагаются в пределах 50-200 пар оснований от участка старта транскрипции и содержат сайты связывания белков - активаторов транскрипции.

    Дистальные элементы, представляющие собой энхансеры, могут располагаться на произвольном расстоянии в любой ориентации по отношению к участку старта транскрипции.


    Какие факторы нужны для инициации транскрипции РНК полимеразой II. Формирование преинициаторного комплекса, его судьба в процессе инициации.

    Для правильной инициации транскрипции РНК полимеразой II в зоне корового элемента промотора должны собраться соответствующие инициаторные факторы, называемые TFII (Transcription Factors of RNA polymerase II). Среди них: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF и TFIIH. Из вышеупомянутых факторов лишь TFIID способен напрямую взаимодействовать с промоторной областью ДНК, остальные факторы удерживаются в промоторной области посредством белок-белковых взаимодействий друг с другом и с TFIID.

    Специфическое связывание TFIID с ДНК является начальным этапом инициации транскрипции. В основе этого события лежит специфическое взаимодействие ТАТА - связывающего компонента TFIID (TBP - TATA Binding Protein) с соответствующим участком ДНК.

    Связывание TBP с ТАТА-боксом запускает каскад событий, приводящий к формированию преинициаторного комплекса: с TBP-TATA комплексом связывается инициаторный фактор TFIIB, с TFIIB связывается преформированный комплекс полимеразы II с инициаторным фактором TFIIF. Считается, что таким образом реализуется одна из функций TFIIB, состоящая в правильном позиционировании полимеразы относительно промотора. С TFIIF связывается инициаторный фактор TFIIE, с TFIIE связывается фактор TFIIH. На этом формирование преинициаторного комплекса заканчивается.

    В преинициаторном комплексе TFIIH проявляет киназную активность - фосфорилирует С - концевой домен большой субъединицы РНК полимеразы II. Тем временем хеликаза АТФ - зависимо расплетает двойную спираль ДНК в районе старта транскрипции. Формируется так называемый "открытый" комплекс. Полимераза уходит с промотора и начинает элонгацию. После ухода полимеразы TFIID остаётся связанным с коровым элементом промотора в течение некоторого времени и может принять участие в новом раунде инициации. После терминации транскрипции специальная фосфатаза возвращает большую субъединицу полимеразы в дефосфорилированное состояние. Таким образом восстанавливается способность полимеразы инициировать транскрипцию.


    Регуляция инициации транскрипции полимеразой II. Базальная транскрипция и активатор - зависимая транскрипция.

    Инициация транскрипции с промоторов класса II регулируется на уровне сборки мультибелкового преинициаторного комплекса в районе промотора.

    Одной из форм регуляции является взаимодействие базальных компонентов преинициаторного комплекса с белками - активаторами, связанными с проксимальными или дистальными элементами промотора.

    Другая форма регуляции - посредством прямого связывания соответствующих активаторов с компонентами преинициаторного комплекса. Например, TBP - ассоциированные факторы (TAF's), входящие в состав TFIID, являются мишенью для ген-специфических активаторов транскрипции таких как p53, NF kappa B, эстрогеновый рецептор и другие.

    В регуляции инициации также принимают участие белки, называемые non-TAF коактиваторами. Примером такого рода служит дрожжевой белок GCN5. Эти белки играют роль адаптеров между активаторами и факторами, входящими в состав преинициаторного комплекса.

    Разнообразные регуляторные взаимодействия имеют место и между самими факторами инициации транскрипции. Например, отмечены взаимодействия между dTAF42 (а также его человеческим гомологом hTAF31) и фактором инициации TFIIB. Показано, что hTAF80 взаимодействует с TFIIF. Вероятно, роль подобных взаимодействий состоит в том, чтобы дополнительно стабилизировать преинициаторный комплекс и облегчить привлечение последующих факторов.

    Существует минимальный набор белков, достаточный для того, чтобы инициировать транскрипцию с промотора класса II in vitro. Это - перечисленные выше основные компоненты преинициаторного комплекса. Однако, вышеупомянутые белки способны обеспечить довольно низкий уровень транскрипции, называемый базальным. Причиной подобного эффекта принято считать препятствия, возникающие in vivo в виде негативных регуляторов инициации транскрипции, структуры хроматина и так далее. Считается, что в клетке такого рода препятствия преодолеваются с помощью активаторов транскрипции, взаимодействующих как с ДНК в районе промотора, так и с базальными факторами, входящими в состав преинициаторного комплекса.


    TFIID - ключевой фактор инициации транскрипции с промотора класса II. Состав. Архитектура. Что с чем взаимодействует.

    TFIID является ключевым фактором инициации транскрипции с промотора класса II.

    Это - единственный инициаторный фактор, способный специфически связываться с промоторной областью ДНК. Способность TFIID связываться с ДНК была продемонстрирована методом футпринтинга с использованием ДНКазы I на ряде вирусных и человеческих промоторов. Было обнаружено взаимодействие TFIID с ТАТА-боксом, зависимое от наличия в составе фактора специфического ТАТА - связывающего белка - TBP.

    К настоящему моменту гены, кодирующие ТВР, проклонированы и секвенированы для дрожжей, человека, дрозофилы, других эукариот и археабактерий. Как и следовало ожидать, этот белок оказался довольно консервативным. Особенно консервативны остатки, ответственные за связывание с ДНК и С - концевой район, взаимодействующий с TAF's. Рекомбинантный ТВР способен связывать основные инициаторные факторы и запускать сборку преинициаторного комплекса in vitro. В то же время, для активатор - зависимой транскрипции необходимо присутствие TBP - ассоциированных факторов (TAF's), входящих в состав TFIID in vivo, и некоторых non-TAF коактиваторов.

    На данный момент охарактеризован и очищен целый ряд TAF дрожжей, человека и дрозофилы. Среди них обнаружились высокогомологичные белки с похожими функциями в составе TFIID, что говорит о высокой консервативности этого фактора и указывает на возможность существования общего предкового TFIID.

    Анализ структуры TAF выявил в их составе такие мотивы как, бромодомен, HMG домен, гистонподобные мотивы и другие.

    Существует теория, согласно которой в процессе эволюции домены, участвующие в регуляции активности полимеразы II, перераспределялись между разными транскрипционными факторами. К примеру, в составе гомологичных hTAF250 и dTAF250, обладающих гистонацетилтрансферазной активностью, найдены HMG домен и бромодомен. Их дрожжевой гомолог yTAF130 не содержит бромодомена и не является гистонацетилтрансферазой. Для выполнения соответствующей функции yTAF130 рекрутирует в преинициаторный комплекс non-TAF коактиватор - гистонацетилтрансферазу GCN5, содержащую бромодомен.

    Несмотря на ряд фактов, подобных приведённому выше, общая архитектура TFIID филогенетически консервативна. Этот комплекс удерживается за счёт взаимодействия C - концевого участка TBP с рядом TAF's и взаимодействий TAF's друг с другом. Тем не менее, существуют альтернативные формы TFIID, не содержащие какого-либо TAF компонента или содержащие его минорную сплайс-форму. Например, существует так называемый B-TFIID, состоящий из ТВР и единственного TAF, гомологичного АТФ - зависимому ингибитору связывания ТВР с ТАТА.

    Помимо запуска сборки преинициаторного комплекса в районе промотора класса II, для TFIID выявлена ещё одна важная и интересная функция. Известно, что белковая машина, осуществляющая процессинг предшественника мРНК - кэпирование, сплайсинг и полиаденилирование, in vivo строго специфически направляется на транскрипты, синтезированные РНК полимеразой II. Этот факт наводит на мысль о связи вышеупомянутой машины с полимеразой II. Недавно обнаружилось, что CPSF - белковый комплекс, узнающий сайт полиаденилирования и привлекающий туда остальные компоненты машины, связывается с TFIID и тем самым рекрутируется в преинициаторный комплекс. После фосфорилирования большой субъединицы РНК полимеразы II CPSF отделяется от TFIID и оказывается ассоциирован с элонгирующей полимеразой и таким образом, вероятно, переносится на сайт полиаденилирования.


    ТВР. Строение. Связывание с ДНК. Последствия связывания ТВР с ДНК. Взаимодействие ТВР с TFIIB.

    В рамках процесса инициации транскрипции РНК полимеразой II ТВР взаимодействует с промоторной областью ДНК, инициаторными факторами TFIIA и TFIIB, С - концом большой субъединицы РНК полимеразы II, некоторыми негативными кофакторами (например, NC1 и NC2, ингибирующими связывание с TFIIB) и рядом активаторов транскрипции. При этом связывание ТВР с полимеразой и TFIIB запускает сборку преинициаторного комплекса, а TFIIA скорее всего конкурирует с негативными кофакторами за связывание с ТВР.

    ТВР представляет собой внутримолекулярный димер, каждый мономер которого построен из пяти антипараллельных b тяжей и двух a спиралей. Молекула подразделяется на высоко консервативный С - концевой участок, включающий в себя её основную часть и неконсервативный N - концевой участок. N - концевой участок ТВР варьирует по длине у разных организмов, средняя длина составляет 18 аминокислот. Этот участок, по-видимому, не является критическим для транскрипции - известны линии дрожжей, экспрессирующие функционально полноценный ТВР, лишённый N - конца.

    По форме ТВР напоминает седло, вогнутая часть которого сформирована восемью антипараллельными b тяжами и отвечает за взаимодействие с малой бороздкой ДНК. Выпуклая часть седла сформирована четырьмя a спиралями, линкерным участком и неконсервативным N - концевым участком. Эта часть отвечает за белок - белковые взаимодействия, осуществляемые в рамках TFIID и преинициаторного комплекса.

    В ходе взаимодействия ТВР с ДНК реализуется следующая цепь событий: сначала происходит интеркаляция белка в малую бороздку ДНК, зависимая от остатков фенилаланина. Далее следует узнавание белком области ДНК, лишённой GC пар - ТАТА-бокса. В процессе узнавания ключевую роль играют остатки валина, принадлежащие ТВР. Заключительным этапом связывания является сиквенс-специфическое формирование водородных связей между молекулой белка и соответствующим участком ДНК.

    В результате связывания ТВР с ТАТА-боксом происходит изгиб ДНК на 70 градусов. Такая деформация облегчает расплетание двойной спирали в районе старта, координирует сборку преинициаторного комплекса (сборка вокруг изгиба обеспечивает лучшую компактизацию комплекса), помогает приблизить к преинициаторному комплексу удалённо связанные транскрипционные факторы, а также позиционирует ДНК таким образом, что с ней могут связываться новые факторы базальной транскрипции.

    Хрошим примером такого рода является инициаторный фактор TFIIВ. TFIIB связывается с определённой областью ТВР и участком сахарофосфатного остова ДНК, открывшимся в результате ТВР - ТАТА-бокс взаимодействия.

    На уровне TFIIB контролируется полярность посадки ТВР на ТАТА-бокс. Дело в том, что из-за квазисимметричности ТАТА - последовательности ТВР может связаться с ней ни в той ориентации (для правильной инициации транскрипции белок должен быть обращён С - концом к 5' концу ТАТА). В данном случае участок сахарофосфатного остова ДНК, необходимый для связывания TFIIB, оказывается открытым. Однако фактор не может включиться в преинициаторный комплекс из-за того, что не доступен нужный участок ТВР.


    ТВР - ассоциированные факторы (TAF's). Домены и функции. Взаимодействия друг с другом и другими факторами транскрипции.

    Не менее важной чем ТВР составляющей инициаторного фактора TFIID являются ТВР - ассоциированные факторы (TAF's).

    Некоторые TAF's обнаруживают существенную гомологию с гистонами: dTAF42 и его человеческий гомолог hTAF31 подобны гистону Н3, dTAF62 и hTAF80 подобны гистону Н4, dTAF30a/22 и hTAF20/15 - гистону Н2В.

    У дрозофилы был выделен и охарактеризован димер dTAF42 и dTAF62. Оказалось, что в рамках димера оба белка имеют классическую гистоновую складку - одна длинная a спираль и две коротких, структура типа helix-loop-helix-loop-helix. Структура вышеупомянутого димера сильно напоминает структуру гетеродимера соответствующих гистонов. Вне гетеродимера dTAF42 и dTAF62 не имеют гистоновой складки. Выделен также гетеротетрамер вышеупомянутых TAF's, напоминающий по структуре гетеротетрамер соответствующих гистонов. Интересно, что конфигурация остатков, представленных на поверхности гетеротетрамера TAF's, сходна с подобной гетеротетрамера Н3/Н4. Таким образом, гетеротетрамер TAF's скорее всего способен взаимодействовать с ДНК.

    В составе TFIID содержится четыре копии hTAF20 - гомолога гистона Н2В. Обнаружены гистонподобные взаимодействия между hTAF31 и hTAF20. Возможно TFIID содержит структуру, напоминающую гистоновый октамер и способную взаимодействоватьс ДНК.

    Считается, что существуют коровые TAF's, входящие в состав любого TFIID и специфические TAF's, входящие в состав определённых TFIID. В зависимости от TAF's, входящих в состав фактора, разные формы TFIID отличаются по функциям. Функция TFIID представляет собой комбинацию функций TAF's, входящих в его состав.

    Например, dTAF250 и hTAF250 являются гистонацетилтрансферазами, hTAF30 взаимодействует с эстрогеновым рецептором. hTAF68 содержит РНК связывающий домен, способен связываться с РНК и одноцепочечной ДНК. Предполагается, что hTAF68 принимает участие в переходе преинициаторного комплекса из закрытого в открытый, отвечает за селективное узнавание нужного промотора определённым TFIID или же принимает участие в переходе от инициации к элонгации посредством связывания с новосинтезированной молекулой РНК.

    Существуют тканеспецифические TAF's. Например hTAF105 содержится только в зрелых В лимфоцитах. Вероятно, подобные TAF's определяют тканеспецифическую экспрессию ряда генов.


    TATA-less промоторы.

    Как уже упоминалось выше, существуют промоторы класса II, не содержащие TATA - последовательность - так называемые ТАТА-less промоторы (смотри "DPE промотор"). Для инициации транскрипции с таких промоторов также необходим TFIID. Однако при этом не важно, способен ли ТВР, входящий в состав TFIID, связываться с ТАТА-элементом. Мутанты, содержащие нефункциональный ТВР, оказывались способными эффективно запускать сборку преинициаторного комплекса в районе ТАТА-less промотора. Есть мнение, что в узнавании ТАТА-less промотора основную роль играет взаимодействие TAF's с инициаторным участком, расположенным в районе старта транскрипции. Известно, что dTAF150 способен специфически связываться с ДНК в районе промотора. В то же время известны белки - TFII-I, способные специфически связываться с инициаторным участком промотора класса II. Таким образом, узнавание TATA-less промотора происходит либо благодаря взаимодействию неких TAF's с промоторной областью ДНК, либо за счёт специфического связывания TAF's с белками сидящими на инициаторном участке промотора.


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100