на главную страницу
 > Обзоры > Visual Cloning 2000 > Первый опыт работы.

Первый опыт работы с Visual Cloning 2000.

Игорь Хмельков
Эти же материалы в формате MS Word можно забрать на сайте WETWARE.

    Попробуем выполнить какую-либо рутинную задачу, используя возможности VC. Предположим, нам необходимо построить карту плазмиды pBR322, имея только ее последовательность и обладая некоторыми априорными знаниями о структуре карты (последовательность можно взять здесь).

    Нуклеотидную последовательность для нашего эксперимента можно выгрузить из какой-либо другой программы или скачать из Интернет. Вместе с VC поставляется некоторое количество файлов-образцов, там есть и pBR322, но эта последовательность уже отмаркирована, а нам нужна чистая.

    Последовательность должна находиться в текстовом файле с расширением *.txt (кстати сказать, VC понимает значительное количество форматов, но это предмет другого разговора).

    Начнем работу.

    new map

    Итак, текстовый файл с последовательностью для pBR322 получен. Запускаем программу VC.

    В открывшемся окне программы, слева в верхней части экрана кликнем на пиктограмме "New Map" или в меню File выберем опцию с аналогичным названием.

    Так как мы собираемся строить геномную карту из текстового файла, то в появившемся окне Мастера, выберем опцию "From a sequence file...". Клавиша Browse... позволит нам найти файл в нашей файловой системе.


    Построение карты, первый шаг

    Нажмем на клавишу "Далее", и в следующем окне выберем тип молекулы и назовем ее.


    Построение карты, второй шаг

    Нажмем на клавишу "Готово". Получим в некотором смысле "серый" результат.


    Построение карты, серый вариант

    Конкретизируем задачу

    Нужно решить, что бы хотелось видеть на карте. Для этого составим небольшую таблицу:


    Элементы, которые хотелось бы отразить на карте Обозначение Характеристика или специфические особенности, которые можно использовать для поиска и маркировки элемента
    Рестрикционные сайты ApaLI, AvaI, BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SapI, ScaI, SphI  
    Точка начала репликации (origin of replication) ORI Позиция 2535
    Белок - репрессор (ROP-protein) ROP Позиция с 1915 по 2106
    Ген устойчивости к ампицилину Amp(R) Позиция с 3293 по 4156, комплементарная последовательность
    Ген устойчивости к тетрациклину Tet(R) Позиция с 86 по 1276, прямая последовательность
    Последовательность Шайна - Дальгарно SD SEQ 1905 – 1909 GGAGG – в нижней части карты (прямая последовательность)
    4161 – 4165 GAAAA – в верхней части карты (комплементарная последовательность)
    Промоторы P1, P2, P3 Позиция 27 – 33, комплементарная последовательность;
    Позиция 43 – 49 прямая последовательность;
    Позиция 4188 – 4194 комплементарная последовательность.
    Y-эффектор сайт H_Y_EFF
    L_Y_EFF
    Позиция 2011 – 2167
    Позиция 2351 – 2414 (комплементарная)

    Начнем с рестриктаз.

    Нажмем на клавишу "Restriction Analysis" на вертикальной панели VC. В результате, в верхней части окна программы откроется панель с аналогичным названием. Теперь включим опцию "Select individual enzymes" и отметим в списке ферменты (ApaLI, AvaI, BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, PstI, SapI, ScaI, SphI). После этого, нажмем на клавишу "Search".

Выбор рестриктаз

    В результате будет найдено 12 сайтов (все указанные нами рестриктазы "сработали", а для ApaLI найдено 3 сайта). Добавим найденные сайты на карту ("Add Sites on Map").


    Перенос рестриктаз на карту

    После добавления сайтов на карту следует нажать на клавишу "Map View", тогда панель в верхней части окна исчезнет и не будет мешать в оценке результата. Кстати, все метки, в том числе и название карты, перемешаются при помощи мыши, а карта легко масштабируется – достаточно кликнуть в каком либо месте карты и перетащить один из уголков области выделения. Метки можно покрасить и изменить параметры шрифта для большей наглядности.


    рестриктная карта плазмиды

    Займемся последовательностями.

    Попробуем показать на карте последовательности Шайна–Дальгарною Для них мы знаем точный порядок нуклеотидов. Нажмем на клавишу "Subsequence Search", расположенную внизу вертикальной панели VC. Также как и для рестрикционного анализа, в верхней части окна программы появится панель Subsequence Search.

    В поле "Find Sequence" введем первую последовательность GGAGG. Установим опцию "Entire sequence" (если она не установлена по умолчанию). Далее, нажмем на клавишу "Search". Программа найдет 5 регионов, из которых последовательностью Шайна–Дальгарно является только верхний (позиция 1905 - 1909). Установим флажок в строке с этими параметрами, и отметка сразу появится на карте.


    Поиск последовательности

    Символы "+" и "–" в столбце Direction указывают на направление чтения последовательности. Таким образом, для последовательности AGT программа будет искать еще и TGA.

    Проведем аналогичную процедуру и для второй последовательности. Нас интересует последовательность, комплементарная GAAAA. Надо учесть, что Subsequence Search ищет только в прямой последовательности (как либо заставить программу искать в комплементарной последовательности у меня не получилось), поэтому искать надо CTTTT. Искомая последовательность будет под пятым номером в перечне результатов поиска. Для того чтобы поместить последовательность на нашу карту, отметим ее флажком.


    Карта, построенная автоматически

    Программа решила переместить название карты в центр, да и отмеченные последовательности хорошо бы переименовать. Поэтому модифицируем полученную карту. Переместим название карты, а затем, выделим метки найденных последовательностей (удерживая клавишу <Ctrl> или <Shift>), кликнем правой клавишей мыши на одной из меток и в выпадающем меню выберем опцию Properties. В появившемся окне, в поле "Name" укажем имя SD SEQ. Затем пользуясь инструментами из верхней панели программы поменяем размер шрифта и цвет надписей.


    Карта после настройки

    Нанесем на карту маркеры и регионы.

    В режиме "Map View" выберем на верхней панели инструментов пиктограмму "Add Region".


    Добавление областей

    В появившемся окне, в поле "Name" зададим название первого региона Tet(R) для гена устойчивости к тетрациклину, укажем начало и конец региона и его направление, а также выберем цвет.


    Ввод свойств выбранной области

    После того, как все параметры заданы, нажмем на клавишу "Add Another" (вместо клавиши ОК). Регион появится на карте, а мы сможем продолжить ввод параметров для следующего региона. Последовательно добавим ген устойчивости к ампицилину Amp(R), ROP-протеин, промоторы и эффектор-сайты.

    Теперь нанесем на карту маркер точки начала репликации ORI. Для этого нажмем на пиктограмму "Add Marker" (она находится справа от пиктограммы "Add Region"). В появившемся окне зададим имя и позицию маркера (ORI, позиция 2535). Ну и, наконец, поработаем немного со шрифтом добавленных меток. На мой взгляд, получилось неплохо.


    Готовая карта


Эти же материалы в формате MS Word можно забрать на сайте WETWARE;
"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru;
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100