на главную страницу
 > Обзоры > Vector NTI > Конструирование молекул.

Конструирование молекул.

Игорь Хмельков
Эти же материалы в формате MS Word можно забрать на сайте WETWARE.

    В данном разделе описана процедура конструирования новой DNA молекулы. В терминах Vector NTI, конструирование – это создание молекул из полностью предопределенных фрагментов, сочетание которых определяется пользователем программы.

    Конструирование молекулы DNA выполняется по следующей схеме:

    1. Выбор и описание фрагментов молекулы;
    2. Создание списка фрагментов, описывающего целевую молекулу (Goal Molecule Definition List);
    3. Вызов соответствующего инструмента и собственно конструирование молекулы.

    Молекула DNA может быть собрана из различных типов фрагментов – из фрагментов существующих молекул, линкеров, адаптеров и т.п. Значительная часть работы при конструировании молекул - это определение фрагментов, описание линкеров и адаптеров занимает значительно меньше времени. К счастью, в составе Vector NTI есть специальный инструмент – Мастер фрагментов (Fragment Wizard), который "руководит" пользователем в процессе описания нового фрагмента и обеспечивает быстроту и прозрачность процедуры.

    В дополнении к Fragment Wizard для определения фрагментов можно использовать Редактор фрагментов (Fragment Editor). С помощью редактора легко описываются любые фрагменты, однако наиболее эффективно он может быть использован при определении линкеров и адаптеров.

    Кроме конструирования, в рамках инструментария Vector NTI для создания и добавления новой молекулы в базу данных существует целый ряд возможностей, в частности:

    • Описание молекулы может быть импортировано из GenBank, EMBL, FASTA;
    • Для описания молекулы может быть использована последовательность из какого-либо текстового файла;
    • Молекула может быть разработана по правилам встроенной в Vector NTI базы биологических знаний.

    Молекулы, которые собраны из фрагментов, в терминах Vector NTI называются сконструированными молекулами. Молекулы, описание которых импортировано или составлено вручную, называются базовыми молекулами, т.к. они записываются в базу данных как нечто целое в противовес сконструированным молекулам, для которых вместе с общими данными записывается информация об исходных фрагментах.

    Сформулируем задачу

    Итак, наша задача – создать новую молекулу на базе клонирования гена устойчивости к тетрациклину из pBR322 в pUC19, используя сайты рестрикции EcoRI и AvaI в pBR322, EcoRI и SmaI в pUC19.

    Откроем Display Window

    Откроем Display Window для pBR322 и pUC19. Для этого запустим программу Vector NTI, окно Database Explorer откроется автоматически (его также можно вызвать из работающей программы, кликнув на соответствующую пиктограмму). Выберем базу данных DNA/RNA Molecules (MAIN) и в перечне молекул найдем pBR322 и pUC19. Молекулы нужно выбрать мышкой (однократный клик) при нажатой клавише Ctrl. Далее необходимо из меню DNA/RNA выбрать команду Open. В программе откроется по одному Display Window для каждой молекулы.

    Максимизируем оба окна (кнопка в верхнем правом углу), при этом естественно мы будем видеть только одно Display Window (для pBR322), а второе будет скрыто. Переключаться между окнами можно с помощью команд меню Window программы Vector NTI. Уменьшим текстовое поле в каждом окне и увеличим графическое таким образом, чтобы обозначения свойств и метки были четко видны.

    Теперь можно приступить к определению целевой молекулы.

    Определим первый фрагмент

    Первый фрагмент будет состоять почти полностью из молекулы pUC19. 5’ конец фрагмента будет соответствовать сайту SmaI, а 3’ – сайту рестрикции EcoRI.

    Активируем pUC19 Display Window. Сделаем графическую часть окна активной (однократный клик в поле графической части или клик на соответствующей пиктограмме).

    Теперь нажмем клавишу Add Fragment to Molecule Goal List.


     
     

    В результате откроется диалоговая панель Fragment Wizard. Fragment Wizard – это последовательность диалоговых панелей, описывающих соответствующие действия пользователя, которые необходимо выполнить для определения фрагмента. Если случайно в процессе определения будет сделана ошибка, можно будет вернуться к предыдущим действиям (нажатием на клавишу Back). Заметим, что окна Мастера не являются модальными и мы можем продолжать работать с Display window, перемещая панель Мастера, так, чтобы она не заслоняла необходимые нам сайты рестрикции.

    На первой панели Мастера выберем опцию Construction Fragment и нажмем на клавишу Next.

    Следующая панель Мастера позволяет определить 5’ конец нового фрагмента. Кликнем на метке сайта рестрикции SmaI (в графическом окне). Координаты и название сайта автоматически перепишутся в окно Мастера. Снова нажмем на клавишу Next.

    Следующий шаг – определение 3’ конца фрагмента. Удерживая кнопку Sift, кликнем на метке сайта EcoRI. Информация о сайте рестрикции также как и в предыдущем случае перепишется в соответствующие поля панели Мастера. Это последняя панель Мастера (клавиша Next заблокирована), поэтому следует нажать на Finish.

    В результате появится окно New Fragment, описывающее основные параметры фрагмента и предлагающее добавить фрагмент в список.

    При нажатии на клавишу Add to list фрагмент будет добавлен в Molecule Goal list. Если представленная о фрагменте информация некорректна, от него можно отказаться, нажав на клавишу Cancel, в этом случае мы вернемся к Мастеру фрагментов.

    Определим второй фрагмент

    Используя меню Window, перейдем к pBR322. Сделаем активной графическую часть окна и нажмем на пиктограмму Add Fragment to Molecule Goal List. В результате снова откроется Fragment Wizard. Переместим панель Мастера так, чтобы были видны сайты EcoRI и AvaI.

    На первой панели мастера выберем опцию Construction Fragment (она будет уже выбрана по умолчанию). Далее выберем сайт EcoRI для 5’ конца фрагмента.

    Нажмем на клавишу Next, и удерживая на клавиатуре кнопку Sift, определим рестрикционный сайт AvaI для 3’ конца.

    При нажатии на клавишу Finish появится уже знакомое нам сообщение о новом фрагменте. Добавим этот фрагмент к списку. Теперь и второй фрагмент нашей молекулы записан в Molecule Goal list.

    Проверим список фрагментов

    Нажмем на пиктограмму Molecule Goal list на основной панели инструментов Vector NTI.

    В результате будет вызвана диалоговая панель Construct Molecule. Как мы видим, список содержит два, определенных нами, фрагмента.

    Введем общую информацию о новой молекуле

    В поле Name: вместо NEWMOL введем название новой молекулы, например My Molecule.

    Нажмем на клавишу General Info и в открывшемся окне введем следующие данные:

    1. В поле Description запишем "My molecule #1";
    2. В группе Extra-Chromosome Replication выберем флаг "Bacteria";
    3. В группе Replicon Type выберем флаг "Plasmid";
    4. В поле Key Words впишем фамилию или псевдоним и нажмем клавишу Add (Это нужно для того, чтобы потом можно было бы разыскать свое "творенье" в общей базе данных).

    Нажмем ОК и вернемся к панели Construct Molecule.

    Обратим внимание на переключатели, расположенные выше секции с фрагментами молекулы. Они позволяют выбрать вариант начала новой молекулы. Первый фрагмент молекулы в списке подготовлен программой в качестве фрагмента "реципиентной" молекулы. Таким образом в качестве старта молекулы можно выбрать либо рецпипиентный фрагмент либо задать конкретные координаты начала. Выберем Recipient Start, в этом случае начало новой молекулы совпадет с началом первого фрагмента (pUC19).

    Попробуем построить молекулу

    Нажмем клавишу Construct в верхнем правом углу панели Construct Molecule. Сначала программа попросит нас выбрать базу данных для новой молекулы. В соответствующее поле введем, например, "My base" и нажмем ОК. Программа сообщит нам, что базы с таким именем не существует и предложит создать ее. Отвечаем утвердительно.

    В процессе конструирования молекулы Vector NTI обнаружит, что левый конец фрагмента #1 (сайт SmaI) не сопоставим с правым концом фрагмента #2 (сайт AvaI). В результате мы получим уведомление от Vector NTI, о том, что он не в состоянии завершить процесс.

    Это произошло потому, что "тупой" конец фрагмента pUC19 (5’) не может быть связан с "липким" концом фрагмента pBR322 (3’). Необходимо модифицировать эти концы, так, чтобы в результате они подошли друг другу.

    Немного биохимии

    В панели Construct Molecule однократным кликом выделим второй фрагмент. Клавиша Edit станет активной. Нажмем на Edit – откроется диалоговая панель Fragment of Molecule (Фрагмент-Редактор).

    Нам необходимо модифицировать AvaI сайт, который формирует правый конец нашего фрагмента. Нажмем клавишу Right Terminus – откроется панель Right Terminus (Terminus Editor).

    Для того, чтобы подправить конец в Terminus Editor нам необходимо провести биохимическую процедуру. Обратим внимание на левую нижнюю часть панели редактора, там расположена секция Biochemical Operations.

    Vector NTI "умеет" выполнять до трех последовательных биохимических операций над концом фрагмента, однако на этот раз, нам необходима всего одна операция – достройка липкого конца сайта AvaI. Выберем в верхнем раскрывающемся списке секции Completely filled in.

    Теперь нажмем последовательно клавишу ОК в Terminus Editor и во Fragment Editor. Мы вновь попадем на панель Construct Molecule. Нажмем на клавишу Construct и ответим утвердительно по поводу использования базы My base и по поводу того, что информацию о нашей молекуле в базе следует переписать (Overwrite). Vector NTI проанализирует нашу молекулу и в этот раз запишет ее в базу данных без каких либо проблем.

    Посмотрим, что получилось

    После создания новой молекулы и записи информации о ней в базу данных Vector NTI открывает для нее Display Window. Найдем на изображении молекулы TC(R) и заметим, что мы не вводили функциональность и карту рестрикции в ручную, все это программа сформировала автоматически.

    Обратим внимание на текстовую панель Display Windows. В описании молекулы появилась папка "Component Fragments". В этой папке мы увидим два наших фрагмента.

    Мы собрали молекулу, определив все необходимые сайты рестрикции и биохимические операции для клонирования фрагмента из pBR322 в pUC19. Подобная работа на основе пользовательских параметров, в терминах Vector NTI называется конструированием. Ту же операцию по клонированию, сопровождаемую перемещением TC(R) из pBR322 в pUC19, можно выполнить без указания сайтов и биохимических операций. Все это можно поручить Vector NTI, подобная работа в терминах программы называется дизайном молекулы, однако описание этой процедуры выходит за рамки данного раздела.


Эти же материалы в формате MS Word можно забрать на сайте WETWARE;
"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru;
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100