Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с D. melanogaster > Выделение ядерного экстракта из мух 2.

Выделение ядерного экстракта из небольшого количества мух.


Илияс Ахметоллаев,
Институт биологии гена РАН;

Несложный и достаточно быстрый метод для получения ядерного белкового экстракта из небольшого количества взрослых мух. Полученный экстракт можно использовать для вестернов.

  1. Сделать градиент в пробирке Эппендорф 2ml: буфер CKS-S1800 400µl, буфер CKS-S800 400µl;
  2. Собрать 50 мух и перенести их в пробирку Эппендорф 1.7ml с 200µl буфера CKS. Гомогенизировать тефлоновым пестиком. Добавить 200µl буфера CKS хорошо перемешать. Все делать во льду;
  3. Пропустить гомогенат через Merocloth;
  4. Фильтрат наслоить на градиент. Центрифугировать 4500rpm, 20', 4oС, в бакет-роторе;
  5. Отобрать ядра (в интерфазе между CKS-S1800 и CKS-S800). Ядра суспендировать в 200µl CKS буфера;
  6. Центрифугировать 4500rpm, 20', 4oС, в бакет-роторе;
  7. Супернатант слить, ядра суспендировать в 200µl, буфера CKS ( добавить PIC, 1mM PMSF). Центрифугировать 4500rpm, 20', 4oС, в бакет-роторе. Супернатант слить;
  8. Измерить объем полученных ядер. Добавить равный объем буфера для экстракции. Гомогенизировать;
  9. Инкубировать 2h при 4oС на качалке;
  10. Центрифугировать 13500rpm, 15', 4oС
  11. Супернатант отобрать (растворимые белки), осадок растворить в буфере с мочевиной.

    Растворы.

    Буфер CKS 2x

    Конц.Сток10ml100ml
    PIPES pH6.810mM302g/M0.03g0.3g
    NaCl100mM5M0.2ml2ml
    MgCl23mM1M30µl300µl
    EGTA1mM0.5M20µl200µl
    DTT1mM1M10µl100µl
    Triton-X1000.2%10%0.5ml5ml
    H2O mQдо 10mlдо 100mlдо 

    Буфер CKS-S800

    Конц.Сток10ml100ml
    CKS 2x1x2x5ml50ml
    сахароза0.8M342g/M2.74g27.4g
    H2O mQдо 10mlдо 100mlдо 

    Буфер CKS-S1800

    Конц.Сток10ml100ml
    CKS 2x1x2x5ml50ml
    сахароза1.8M342g/M6.16g61.6g
    H2O mQдо 10mlдо 100mlдо 

    Буфер для экстракции

    Конц.Сток10ml100ml
    Tris-HCl pH 7.610mM1M0.1ml1ml
    KCl1.2M3M4ml40ml
    Глицерин0.5%100%50µl500µl
    DTT1mM1M10µl100µl
    NP-400.05%10%50µl500µl
    H2O mQ5.79ml57.9ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Протокол расчитан примерно на 50 мух. Для выделения ядерного экстракта из большего количества мух, можно использовать этот протокол.
  • По пунктам.

    п. 3.

  • Merocloth - это синтетическая ткань, которая выполняет роль фильтра.
  • п. 4,6,7.

  • Если нет миницентрифуги с бакет-роторами, можно сделать отверстие в крышке 15ml пробирки, вставить в него эппендорф и крутить в большой центрифуге для пробирок. 4500rpm - указаны обороты для большой центрифуги. Если есть миницентрифуга с бакет-роторами, то крутить в ней при максимальных оборотах.
  • п. 8.

  • Обычно объем ядер получается примерно 50µl.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100