Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с D. melanogaster > Выделение ядерного экстракта из мух.

Выделение ядерного экстракта из мух.


Лариса Мельникова,
Павел Марданов,
Дарья Копытова,
Институт биологии гена РАН;

Несложный метод для получения ядерного белкового экстракта из взрослых мух. Полученный экстракт можно использовать для вестернов, иммунопреципитаций и.т.д.

  1. Растереть 1g мух в жидком азоте, перенести во флакон, содержащий 5ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии;
  2. Перенести суспензию в стеклянный гомогенизатор, гомогенизировать (10-15 пассажей) на льду;
  3. Осторожно, по стенке, наслоить суспензию на сахарозный буфер. Соотношение буфер:суспензия=3:1. Центрифугировать 1600g, 5', 4oC;
  4. Супернатант слить, интерфазу и ядра растворить в 3ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии;
  5. повторить п.3;
  6. Супернатант слить, ядра суспендировать в 3ml буфера А, пропустить через Merocloth, центрифугировать 1600g, 5', 4oC;
  7. Супернатант слить, ядра (неплотный осадок) ресуспендировать в 3ml NU-2;
  8. Центрифугировать 12 krpm, 10', 4oC;
  9. Супернатант слить, осадок ресуспендировать в 3ml NU-2, гомогенизировать в Даунс гомогенизаторе, перенести в ультрацентрифужную пробирку;
  10. Добавить 1/10V 4М NH4SO4. Перемешивать 20' на ротаторе, 4oC;
  11. Центифугировать 35krpm (Beckman Ti-55), 4oC, 1h;
  12. Добавить к супернатанту 0.3g/ml растертого NH4SO4. 10' на мешалке;
  13. Центрифугировать 12 krpm, 30', 4oC;
  14. Осадок ресуспендировать в 500µl HEMG-40;
  15. Диализовать 40' против 100ml HEMG-40;
  16. Центрифугировать в эппендорфах на максимальной скорости (14krpm) в центрифуге с охлаждением;
  17. Супернатант заморозить в жидком азоте и хранить на -70oС.

    Растворы.

    Буфер А Сток 2x

    Конц.Сток100ml200ml
    Tris-HCl, pH 7.430mM1M3ml6ml
    KCl120mM1M12ml24ml
    NaCl30mM5M0.6ml1.2ml
    EDTA2mM0.5M40µl80µl
    EGTA0.2mM0.5M4µl8µl
    H2O mQдо 100mlдо 200mlдо 

    Буфер А

    Конц.Сток20ml100ml
    Буфер А Сток 2x1x2x10ml50ml
    DTT0.5mM1M100µl500µl
    spermin0.15mM200mM15µl75µl
    spermidine0.5mM250mM40µl200µl
    H2O mQ9.845ml49.225ml

    Сахарозный буфер

    Конц.Сток20ml100ml
    Буфер А Сток 2x1x2x10ml50ml
    DTT0.5mM1M100µl500µl
    spermin0.15mM200mM15µl75µl
    spermidine0.5mM250mM40µl200µl
    Сахароза4M342.3g/M27.38g136.9g
    H2O mQдо 20mlдо 100mlдо 

    NU-2

    Конц.Сток20ml100ml
    Hepes-KOH, pH 7.615mM1M300µl1.5ml
    KCl110mM1M2.2ml11ml
    MgCl25mM1M100µl500µl
    EDTA, pH 8.00.1mM0.5M4µl20µl
    H2O mQдо 20mlдо 100mlдо 

    HEMG-40

    Конц.Сток100ml200ml
    Hepes-KOH, pH 7.625mM1M2.5ml5ml
    KCl40mM1M4ml8ml
    MgCl212.5mM1M1.25ml2.5ml
    EDTA, pH 8.00.1mM0.5M20µl40µl
    Глицерин10%100%10ml20ml
    H2O mQдо 100mlдо 200mlдо 


    Комментарии.

    Общие.

  • Вся работа ведется в холодной комнате.
  • По пунктам.

    п. 4.

  • Ядра могут содержаться как в интерфазе, так и находиться на остатках мух.
  • п. 5.

  • Второй раз пропускают через раствор сахарозы для максимальной очистки ядер от остатков мух.
  • п. 6.

  • Merocloth - это синтетическая ткань, которая выполняет роль фильтра и не пропускает нерастворимые остатки ядер.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100