Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с D.melanogaster > Получение больших популяций дрозофилы.

Разведение D.melanogaster в больших количествах (100 - 150 тыс).

 
Павел Марданов;
Дарья Копытова
Институт Биологии Гена;
группа экспрессии генов.

    Для начала работы необходимо иметь "стартовую" популяцию мух в количестве ~ 1-2 тысячи.

    Для разведения мух используются трёхлитровые ёмкости (лучше пластиковые) с крышкой, в которой проделано отверстие диаметром ~80mm. Отверстие заделано капроном с диаметром отверстий ~0.12mm. В ёмкости заливается корм для взрослых мух (~250ml на одну ёмкость).

    После того, как корм застывает, на него можно высаживать мух. При пересадке мы примариваем мух эфиром. Для оценки количества мух в одной ёмкости удобно пользоваться весами (в среднем, масса одной мухи ~1mg). В одной трёхлитровой ёмкости должно быть не больше 3000 - 3500 мух (при большем количестве получается явное перенаселение и не происходит увеличения количества мух нового поколения). В этом случае можно рассчитывать получить 4000 - 6000 мух нового поколения. После того, как мухи были пересажены, ёмкости с ними необходимо поставить в помещение, в котором поддерживается температура 25oС, влажность 70-75%, а также чередование двенадцатичасовых "дня" и "ночи".

    В последующие несколько дней необходимо ежедневно пересаживать мух на новый корм в новые ёмкости, где они будут по-прежнему откладывать эмбрионы.



    Комментарии.

  • "Стартовая популяция" либо разгоняется из нескольких мух, либо специально поддерживается на температуре 18oС. При 18oС мухи живут по замедленному жизненному циклу и их достаточно перебрасывать на новый корм раз в 2-3 недели.
  • Количество корма подбирается эмпирически. Важны следующие параметры:
    1. корм не должен быть текучим;
    2. личинки должны разрабатывать его по возможности весь;
    3. он не должен быть очень твёрдым (зависит от количества и качества агара), иначе личинки не смогут его разрабатывать (см. "Выявленные проблемы").
  • При пересаживании мух из одной ёмкости в другую удобно их примаривать при помощи ваты или марли, смоченной в эфире. Вата прикладывается к отверстию в ёмкости, а сама ёмкость держится на боку, чтобы мухи не падали на корм, к которому могут прилипнуть. Постукивая по стенкам, мух стрясают в нижнюю часть ёмкости. Далее пёрышком мух сметают в новую ёмкость. На этом этапе могут вызвать проблемы отслаивание корма и влажные стенки ёмкости (см. "Выявленные проблемы").
  • Мы проделывали эту процедуру в течение 7 дней, пересаживая ежедневно мух из четырёх ёмкостей. В каждой ёмкости находилось в среднем по 4000 мух. При этом удавалось получить популяцию примерно в 130000 - 150000 мух. Для сбора эмбрионов мы используем мух от первых 6 перебросок. Те ёмкости, на которые мухи были посажены на 7 день, в дальнейшем используются для поддержания будущей "стартовой популяции".
  • Обычно на 3-4 день в корме становятся видны молодые личинки (см. "Выявленные проблемы"). На 6-7 день личинки начинают выползать на стенки ёмкостей и окукливаться (см. там же.) Взрослые особи вылетают на 10-11 день. Удобно синхронизовать вылет мух от всех перебрасываний. Этого можно достичь, поставив ёмкости с отложенными ранее эмбрионами на 18oС на несколько дней.
  • Выявленные проблемы.

    СитуацияЧто имеет смысл делать
    Личинки есть, но они не могут разрабатывать корм.1. Мы пробовали мазать корм сверху нетолстым слоем нового корма, но без агара. Личинки сразу становятся заметны и подвижны. Этот способ "реанимации" плох тем, что стенки ёмкостей сильно увлажняются. В дальнейшем при перебрасывании мух могут произойти большие потери.
    2. Проверить концентрацию агара в корме.
    Стенки ёмкостей влажные.Подсушить стенки ёмкости либо протерев фильтровалкой, либо вентилятором, стараясь не сильно повредить мух.
    От дна ёмкостей отслаивается корм.Не дать корму придавить мух.
    Личинкам на стенках не хватает места и они, не выползая, окукливаются на корме.Можно вставить в корм картонки, обёрнутые в Saran Wrap, чтобы личинки могли окуклиться на них. Важно, чтобы предлагаемая личинкам поверхность не обладала бы большой гигроскопичностью.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100