Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессионный анализ > Меченье А+РНК и гибридизация.

Random primer на polyA+ RNA.


    Random primer.

  1. в пробирку:
  2. d(N)6 primer (50 OE ~1.7µg/µl) - 1µl
    polyA+RNA ~1.5µg
    H2O до суммарного V=28.5µl в п.4;

  3. 70oC, 5';
  4. 0oC, 2';
  5. добавить:
  6. 5x FSB (first strand buffer) - 6µl
    0.1M DTT - 3µl
    C-mix, 20x - 1.5µl
    RNase Block - 1µl
    a[33P]dCTP (10µCi/µl) - 7µl

  7. 37oC, 2';
  8. + SuperScript RT (200u/µl) /BRL/1.5µl;
  9. 37oC, 1h;
  10. 0oC, определить процент включения по преципитации 10% ТХУ.
  11. Очистка от RNA.

  12. + 3.5µl 3N NaOH;
  13. 68oC, 20';
  14. добавить:
  15. 1M TrisCl (pH 7.4) - 10µl,
    1N HCl - 10.5µl;

  16. чистить на G-50 Spin-колонке:
  17. а) ЦФ 1.5krpm, 1',
    б) сбросить элюат,
    в) нанести на колонку RP-смесь,
    г) ЦФ 2.5krpm, 2';

  18. определить % включения "просчитав" колонку.
  19. Гибридизация.

  20. предгибридизация в HSB(f+) 50oС, ~30'-1h;
  21. гибридизация 50oC ~8h, затем 45oС, ~40h (2x ON);
  22. Отмывка.

  23. (I) 2-3х 15', NT-68oC:
  24. Конц.Сток1L
    SSC1x20x50ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ940ml
  25. (II) 2х 20-30', 68oC:
  26. Конц.Сток1L
    SSC0.2x20x10ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ980ml

    Растворы.

    С -mix

    20x, (хранить при -20oС)

    Конц.Сток100µl
    dATP20mM100mM20µl
    dGTP20mM100mM20µl
    dTTP20mM100mM20µl
    dCTP0.12mM5mM2.4µl
    H2O mQ37.6µl

    HSB (f+)

    high SDS hybridization buffer(хранить основной сток при 4oС, рабочий - NT)

    Конц.Сток500ml
    SDS7%тв.35g
    Formamid50%100%250ml
    283.3g

    SSC5x20x125ml
    145.3g

    Bloc. Reagent2%тв.10g
    NaP (pH 7.0)50mM1M25ml
    27.6g

    N-Lauroylsarcosine Na0.1%10%5ml
    5.1g

    Salm.Sperm DNA50µg/ml10µg/µl2.5ml
    H2O mQ49ml

    p=1.111

    • вместо 2% Blocking Reagent ("Roche Diagnostics GmBH; бывший Boehringer Mannheim"
      #1 096 176) можно использовать 10x Denhardt или сухое обезжиренное молоко.
    • Blocking Reagent можно растворить, лишь в буфере с высокой ионной силой (в данном случае - в H2O+SSC+NaP).
    • Salmon sperm DNA должна быть раздробленной и денатурированной.


    Комментарии.

    Общие.

  • Чувствительность complex hybridization практически одинакова при использовании Р32и Р33(мембрана в обоих случаях завернута в Saran Wrap).
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Если мечение проходит с oligo dT праймера, то вместо (dN)6 нужно взять (dT)6 из расчета ~0.7µg на 1.5µg polyA+RNA.
  • п. 13.

  • Вначале просчитать колонку вместе с элюатом, а затем убрать колонку и просчитать только элюат. Это очень быстрый, но не слишком точный (скорее качественный) метод.
  • п. 14.

  • Очень важно, чтобы мембрана постоянно оставалась влажной начиная с п.14.
  • Сравнивать гибридизационные картинки можно только на мембранах из одного и того же лота.
  • п. 15.

  • Для гибридизации можно использовать тот же буфер, что использовался для предгибридизации, если мембрана новая. Если мембрана была отшпарена, она попадает в гибридизационный стакан влажной и может как-то (неконтролируемо) разбавить гибридизационный буфер. В этом случае мы предпочитаем менять предгибридизационный буфер на новый.
  • Очень важно не слишком экономить на объёме буфера (и внимательно следить, чтобы под мембрану не попали пузыри воздуха), так как иначе на фильтре будут заметны пятна ослабленной гибридизации.
  • п. 16.

  • Отмывку (I) можно проводить при любой температуре от NT до 680C.
  • п. 17.

  • Для горячей отмывки (II) мало поместить стакан с мембраной в горячий гибридайзер. Раствор для отмывки нужно заранее довести до 680C и заливать в стакан уже горячим (лучше заливать в два приёма – первой порцией сполоснуть гибридизационный стакан от старого буфера и одновременно подогреть его, а второй порцией отмывать мембрану указанное время).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100