Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Иммуногистохимия и in situ > Локализация РНК на срезах.

Гибридизация in situ на срезах с mRNA (дрозофила).


    Приготовление препаратов.

  1. приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
  2. сушить в термостате 37oС, ON.
  3. Депарафинирование.

  4. депарафинировать в гистологических стаканах:
  5. ксилол (I) 5'
    ксилол (II) => 5'
    ксилол:EtOH 100% (1:1) => 2'
    EtOH (100%) (I) => 1'
    EtOH (100%) (II) => 1'
    EtOH (96%) => 1'
    EtOH (70%) (I) => 1'
    EtOH (70%) (II) => 1'
    H2O (mQ) => 1';

  6. накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2'.
  7. Предгибридизация.

    все отмывки проводятся в 100 ml стеклоприемниках.

  8. инкубировать 2х 5' в TBS, NT;
  9. 15' {TBS + 0.3% Tween-20}, NT;
  10. 5' TBS, NT;
  11. + 100-200µl TE/Proteinase K на препарат, стекло на 37oС; 5';
  12. сбросить раствор, обмакнув о фильтровалку;
  13. + 100-200µl {TBS + 4% PFA} на препарат, 10';
  14. сбросить раствор;
  15. отмыть 2х 5' в TBS/глицин, NT;
  16. 2х 5' на качалке в TEA/AA;
  17. + 100-200µl предгибридизационного буфера на препарат;
  18. инкубация в заранее прогретой влажной камере 37oС, >10'.
  19. Гибридизация.

  20. сбросить предгибридизационный буфер;
  21. добавить гибридизационную смесь: 30µl гибрид. буфера с 5-10ng DIG-меченной RNA;
  22. накрыть силиконизированным стеклом (без пузырей);
  23. инкубировать при 42oС во влажной камере (фильтровалка, смоченная 4хSSC) ON.
  24. Отмывка.

    в 50 ml стаканах.

  25. осторожно снять покровное стекло под 2хSSC;
  26. 2хSSC NT, 5-10' (не ставить разные гибридизации в один контейнер);
  27. 2x SSC на качалке 37oC, 2х 15';
  28. 1x SSC на качалке 37oC, 2x 15';
  29. + 100-200µl NTE / RNaseA (20µg/ml) на стекло, инкубировать во влажной камере, 37oС, 30';
  30. отмыть в качающейся бане в 0.1хSSC, 37oС, 2х 30'.
  31. стараться работать аккуратно, чтобы не испачкать камеру RNase;
    отметить стакан, используемый только для отмывки от RNase.

    Иммунодетекция.

  32. инкубировать на качалке 2х 10' в В1 (в стеклоприемнике или 50 ml стакане);
  33. + 100-200µl блокирующего раствора на стекло, инкубировать во влажной камере 30' NT;
  34. сбросить раствор, обмакнуть о фильтровалку;
  35. + 100-200µl {B.1 + 0.1% Tween-20 + развед. анти -DIG alkaline phosphate (1:100; 1:500; 1:1000)} на стекло;
  36. NT, 2h во влажной камере;
  37. отмыть на качалке 2х 10' в B.1;
  38. инкубировать 10' в В.2, NT;
  39. приготовить красящий раствор B.2/ NBT/ X-phos./levamisol;
  40. + ~200µl красящего раствора на препарат и инкубировать во влажной камере 2-24h;
  41. оптимальное время инкубации определяется сравнением окрашивания препаратов с sense и antisense зондами.

  42. остановить реакцию в B.3;
  43. отмыть в dH2O.
  44. ЗаключениевTris-glycerol mountant.

  45. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
  46. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
  47. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
  48. подсушить 5-10’ NT;
  49. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
  50. препараты хранить при NT в темноте.

    Растворы.

    TBS

    10x (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10ml
    NaCl1.5M5M30ml
    H2O mQ60ml

    PFA

    ПФА (параформальдегид) 37% (свежеприготовленный для иммуногистохимии).

    1. в пробирке с завинчивающейся крышкой смешать:

    ПФА (тв.) => 0.37g,
    H2O => 1.0ml
    NaOH (1N) => 14µl;

    2. растворить в кипящей водяной бане (растворять до тех пор, пока pH не опуститься до ~7.0 => ~1-3').

    Раствор I

    (хранится несколько дней при 4oС):
    TBS + 0.1% NP-40.

    NTE

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    NaCl500mM5.0M10.0ml
    Tris Cl pH8.010mM1.0M1.0ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml
    H2O mQ88.8ml

    TEA

    1M (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Triethanolamine1M149.19g/M7.46g
    6.66ml

    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml
    H2O mQ43.34ml

    TE/Proteinase K

    (свежеприготовленный) (TE – хранить при +4oC)

    Конц.Сток1ml
    EDTA0.05M0.5M0.1ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M0.1ml
    RNase-free Priteinase K10µg/ml10µg/ml1µl
    H2O mQ0.8ml

    TBS/ 0.1M глицин

    100ml TBS + 0.75g глицина (свежеприготовленный)

    TEA/AA (0.25% v/v)

    100ml TEA + 0.25ml acetic anhydride (уксусный ангидрид) (свежеприготовленный)

    Предгибридизационный буфер

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток2ml
    SSC20х400µl
    формамид деиониз.50% (v/v)100%1.0ml
    H2O mQ600µl

    Гибридизационный буфер

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток2.00ml
    формамид деиониз.40%100%800µl
    декстрансульфат10%50%400µl
    раствор Денхардта1x50х40µl
    SSC4x20х400µl
    DTT10mM1M20µl
    yeast tRNA0.85µg/µl10µg/µl200µl
    Salm. sperm DNA0.85µg/µl10µg/µl200µl

    B1

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10.0ml
    NaCl150mM5M3.0ml
    H2O mQ87.0ml

    B2

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH 9.5100mM1M10.0ml
    NaCl100mM5M2.0ml
    MgCl250mM1M5.0ml
    H2O mQ83.0ml

    B3

    (хранить при 4oС) = TE, pH 8.1.

    Блокирующий раствор

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток100ml
    B10.97x1x97ml
    Triton X-1000.1%10%1ml
    Сыворотка2%100%2ml

    NBT раствор

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток1ml
    NBT75mg/mlтв.75mg
    DMFA*70%100%700µl
    H2O mQ300µl

    X-phosphate раствор

    (хранить при -20oС):

    Сток1ml
    X-phosphate50mg/ml50mg
    DMFA*100%1.0ml

    * - dimetilformamid

    B.2/ NBT/ X-phos./ levamisol

    (свежеприготовленный):

    B.2~100%100%2ml
    NBT0.338mg/ml75mg/ml9µl
    X-phosphate0.175mg/ml50mg/ml7µl
    levamisole1mM (0.24mg/ml)2µl

    левамизол - используется для "забивки" эндогенных фосфатаз.cтоковый раствор (1М) хранится в течение нескольких недель при 4oС.

    Tris-glycerol mountant

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml
    glycerol90%100%9.0ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100