Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Иммуногистохимия и in situ > Белок на политенных хромосомах.

Иммуноокрашивание политенных хромосом.


Приготовление препаратов политенных хромосом.

  1. посадить родителей (~20 мух на пробирку с кормом), ~1 сутки при 25oС;
  2. сбросить родителей, выращивать личинки при 16oС с I до III возраста (~7-8 дней);
  3. приготовить предметные стекла:
    1. - одно для всех препаратов - для вырезания слюнных желез ;
    2. - одно для всех препаратов - для фиксации в растворе II;
    3. - для каждого препарата свое - для фиксации в растворе III, расправления хромосом;
  4. вырезать слюнные железы в капле (~20-30µl) раствора I, удалить жировое тело;
  5. перенести в каплю (~20-30µl) раствора II на 10-30'' (слегка подвигать железы); убрать остатки жирового тела;
  6. фиксировать в капле раствора III (20-30µl) 2';
  7. накрыть покровным стеклом и вращательным движением расправить хромосомы;
  8. фильтровалкой убрать избыток жидкости;
  9. поместить стекло в камеру с жидким азотом, ~20';
  10. сколоть покровное стекло лезвием.
  11. Иммуноокрашивание.

    все дальнейшие отмывки проводить в 100ml стеклоприемниках.

  12. отмыть 2х10' в TBS (покачивая);
  13. накапливать препараты в стеклоприемнике с TBS при +4oС;
  14. инкубировать 30' в TBSTB;
  15. приготовить разведения первичных а/т в TBSTB из расчета ~70-100µl на стекло;
  16. нанести каплю с первичными а/т на препарат;
  17. не накрывая покровным стеклом, инкубировать при NT 2h во влажной камере (фильтровалка смочена водой);
  18. 3х по 5' отмыть в TBSTB (если препаратов мало, использовать 50ml стаканчики);
  19. инкубировать с разведенными вторичными а/т (для FITC 1:25; для Cy3 1:300-500 в TBSTB) NT, 1h во влажной камере;
  20. отмывать 3х5' в TBSTB;

Заключение в Tris-glycerol mountant.

  1. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
  2. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
  3. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
  4. подсушить 5-10' NT;
  5. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
  6. препараты хранить при NT в темноте.

    Растворы.

    TBS

    10x (хранить +4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10ml
    NaCl1.5M5M30ml
    H2O mQ60ml

    TBSTB

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток100ml
    TBS1x10x10.0ml
    serum10%100%10.0ml
    Tween 200.1%10%1.0ml
    H2O mQ79.0ml

    Paraformaldehyde

    ПФА (параформальдегид) 37% (свежеприготовленный для иммуногистохимии).

    1. в пробирке с завинчивающейся крышкой смешать:

    ПФА (тв.) => 0.37g,
    H2O => 1.0ml
    NaOH (1N) => 14µl;

    2. растворить в кипящей водяной бане (растворять до тех пор, пока pH не опуститься до ~7.0 => ~1-3').

    Раствор I

    (хранится несколько дней при 4oС):
    TBS + 0.1% NP-40.

    Раствор II

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток1ml
    TBS0.8x1x800µl
    ПФА3.7%37%100µl
    NP-401%10%100µl

    Раствор III

    (свежеприготовленный):

    Конц.Сток5.0ml
    Укс. к-та50%100% (лед.)2.5ml
    ПФА3.7%37%0.5ml
    H2O mQ2.0m

    Tris-glycerol mountant

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml
    glycerol90%100%9.0ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100