Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Иммуногистохимия и in situ > Белок на срезах взрослых мух.

Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила).


    Приготовление препаратов.

  1. приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
  2. сушить в термостате 37oС, ON.
  3. Иммуноокрашивание.

  4. депарафинировать в гистологических стаканах:
  5. ксилол (I) => 5'
    ксилол (II) => 5'
    ксилол:EtOH (100%) (1:1) => 2'
    EtOH (100%) (I) => 1'
    EtOH (100%) (II) => 1'
    EtOH (96%) => 1'
    EtOH (70%) (I) => 1'
    EtOH (70%) (II) => 1'
    H2O (mQ) => 1';

  6. накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2';
  7. инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике;
  8. 15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
  9. приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло;
  10. убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло);
  11. инкубировать при NT 2h во влажной камере;
  12. отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
  13. приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.;
  14. убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой;
  15. инкубировать при NT 1h во влажной камере;
  16. отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике.
  17. Окрашивание DAB.

  18. растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H2O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр;
  19. нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB;
  20. следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител);
  21. когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB.
  22. Заключение в Tris-glycerol mountant.

  23. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
  24. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
  25. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
  26. подсушить 5-10’ NT;
  27. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
  28. препараты хранить при NT в темноте.

    Растворы.

    TBS

    10x (хранить при +4oС):

    Конц.Сток100ml
    Tris Cl pH7.50.1M1M10ml
    NaCl1.5M5M30ml
    H2O mQ60ml

    Tris-glycerol mountant

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10.0ml
    glycerol90%100%9.0ml
    Tris Cl (pH 8.0)0.1M1.0M1.0ml

    TBSTB

    (свежеприготовленный)

    Конц.Сток100ml
    TBS1x10x10.0ml
    сыворотка10%100%10.0ml
    Tween 200.1%10%1.0ml
    H2O mQ79ml


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Срезы прикрепляются к предметному стеклу, обработанному polyL-lysine или TESPA "Обработка стекол.".
  • п. 6.

  • Предокрашивание. Сыворотка из TBSTB предотвращает неспецифическое связывание первичных антител.
  • п. 8.

  • Жидкость вокруг срезов убирают для того, чтобы не растекался раствор антител.
  • п. 15.

  • Кит: Sigma, #D0426, "Fast DAB with metal enhancer".
  • п. 20.

  • Если пузыри всё же попали, то не надо пытаться их выдавить - поплывут и порвутся срезы, препарат испортится.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100