Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Иммуногистохимия и in situ > Приготовление срезов тканей.

Фиксация и заливка в парафин (дрозофила).


    Фиксация в Корнуа.

  1. на предметном стекле с помощью скальпеля отрезать у мух голову и грудь;
  2. фиксировать в "Корнуа" 2h;
  3. отмывать в 80% EtOH ON;
  4. фиксированные объекты можно хранить в течение 1-2 месяцев при -20oС в 80% EtOH;
  5. Проводка по спиртам и заключение в парафин.

  6. в день заливки в парафин с утра поставить прогреваться все парафины и "кашу" в термостате (56oС);
  7. провести:
  8. EtOH (80%), NT => 30'
    EtOH (96%), NT => 30'
    EtOH (100%) (I), NT => 30'
    EtOH (100%) (II), NT => 30'
    EtOH (100%):ксилол (1:1), NT => 15'
    ксилол (I), NT => 20'
    ксилол (II), NT => 20'
    ксилол:парафин (1:1), 56oC => 40'
    парафин (I), 56oC => 40'
    парафин (II), 56oC => 40';

    Заливка в парафин.

  9. прогреть (в течение 20-30') часовое стекло и подложку бинокуляра в термостате (56oС);
  10. перед заливкой парафина смазать часовое стекло глицерином;
  11. "заливочный" (чистый) парафин => в часовое стекло;
  12. разогретой пипеткой перенести мух в "заливочный" парафин;
  13. ориентировать объект под бинокуляром с помощью препаровальной иглы, нагретой на спиртовке;
  14. опустить стекло в холодную воду, подержав его на поверхности 30-40'';
  15. вырезать при помощи разогретого скальпеля "минимальные" блоки с объектом, наклеить на кубики.

    Растворы.

    Фиксатор Корнуа

    (должен быть свежеприготовленным):

    Конц.Сток10ml
    EtOH60%100%(!!!)6ml
    хлороформ30%100%3ml
    уксусная кислота10%100%,
    ледяная
    1ml

    Приготовление 100% EtOH.

    1. высушить в термостате (65oС, 1-2 суток) медный купорос до почти белого цвета;
    2. засыпать его на 1/4 в емкость, в которой будет находиться 100% EtOH;
    3. добавить 96% спирт, интенсивно встряхивать и оставить на 1-2 суток (CuSO4 "заберёт" воду из спирта).


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1-4.

  • Фиксация и отмывка проводятся либо в небольших бюксиках либо в пенициллиновых пузырьках.
  • п. 5.

  • Ксилольная "каша" (ксилол:парафин (1:1)) должна быть жидкой при 47oС; если расплавится не весь парафин, добавить немного ксилола.
  • п. 6.

  • С помощью пипетки (лучше стеклянной) объекты переносятся в фарфоровые бюксики, в которых и проводятся по "каше" и парафинам I и II.
  • Парафин I и II служат для пропитки объектов парафином и отмывки их от их ксилола.
  • п.9.

  • Для заливки используется чистый парафин, который хранится в отдельном фарфоровом стакане
  • п.13.

  • Залитые в парафин объекты можно хранить при 4oС: для иммуногистохимии - в течении месяца; для гистологии - 3-4 месяца.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100