Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Эукариотические клетки > Основные приёмы работы.

Базовые методы работы с эукариотическими клетками.


Ольга Смирнова
,
Лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта, Институт биологии гена;
Алексей Солдатов,
Вадим Шаров.

    Снятие клеток с культуральных сосудов

  1. слить старую среду;
  2. 2-3 раза промыть клетки HBSS (без Ca2+, Mg2+) или раствором Версена (~3ml на 25 см2);
  3. залить монослой раствором для снятия клеток (чтобы полностью покрывал: ~1ml на 25 см2; но можно и больше, если не жалко);
  4. инкубировать при 370С, периодически аккуратно покачивая. Обычно клетки отделяются от субстрата через 1-10' (время зависит от клеточной линии);
  5. когда клетки полностью отделятся от субстрата, добавить полной среды или PBS и тщательно диспергировать клетки;
  6. если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток: осадить центрифугированием ~200g, 5' и ресуспендировать в полной среде;
  7. считать и субкультивировать.
  8. Замораживание клеток

  9. только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде;
  10. просчитать количество живых клеток;
  11. осадить клетки, центрифугируя при 200-400g 5', удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок;
  12. ресуспендировать клетки в концентрации 1*107 - 5*107 клеток/мл в среде для замораживания с сывороткой или 0.5*107 - 1*107 клеток/мл в среде для замораживания без сыворотки;
  13. разлить в ампулы (2ml пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания. Охладить ампулы в ледяной бане 5' (или в холодильнике на +40С);
  14. клетки необходимо замораживать медленно - понижение температуры со скоростью ~10С в минуту (варианты в зависимости от богатства: (i) программируемый холодильник; (ii) специальный контейнер (от Gibco или Stratagene); (iii) пенопластовая коробка с толщиной стенок ~1см. Контейнер или коробка помещаются в морозильник на -700С - -900С ON);
  15. после замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот.
  16. Размораживание клеток

    Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (ДМСО, глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полной среде.

    а. Метод с отмывкой от криоконсеванта

  17. клетки быстро оттаять при 370С на водяной бане;
  18. поместить 1-2ml клеток в ~25ml полной среды, очень аккуратно перемешать;
  19. центрифугировать клетки при ~80g 2-3' и удалить супернатант;
  20. аккуратно ресуспендировать клетки в полной среде и посчитать количество живых клеток;
  21. рассадить клетки. Количество живых клеток должно быть, по меньшей мере, 3*105 клеток/мл.
  22. б. Метод непосредственной посадки

  23. клетки быстро оттаять при 370С на водяной бане;
  24. посадить клетки в полной среде. Использовать 10-20ml среды на 1ml замороженных клеток. Необходимо сажать не менее 3*105 клеток/мл;
  25. растить клетки от 12 до 24 часов, затем заменить среду свежей чтобы удалить криоконсервант.
  26. Определение количества клеток

    Количество клеток в суспензии можно просчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются.

    Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешивают с равным количеством 0.4% (w/v) раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество "квадратов", в которых просчитываются клетки зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток).


    Камера Горяева. Технические данные.
    • Зазор 0.1mm
    • Сторона малого квадрата 0.05 ±0.001mm
    • Сторона большого квадрата 0.2 ±0.0015mm
    • Сторона сетки 3 ±0.005mm
    • Площадь сетки 9mm2.
    • Объем камеры 0.9mm3.
    Исходная концентрация клеток рассчитывается по следующей формуле:

    Для клеток неразведённой суспензии:
         С [cell/ml] = 2.5*105*(количество клеток в одном большом квадрате)
         С [cell/ml] = 4*106*(количество клеток в одном малом квадрате)
    Для клеток разведённой в два раза (красителем) суспензии:
         С [cell/ml] = 5*105*(количество клеток в одном большом квадрате)
         С [cell/ml] = 8*106*(количество клеток в одном малом квадрате)

    Транспортировка

    либо (более предпочтительно) в сухом льду, замороженными;

    либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток.

    NB! На наш взгляд, лучше предварительно "кондиционировать" новую среду в CO2-инкубаторе.

    Растворы.

    Все среды и растворы для эукариотических клеток готовятся на воде mQ или эквивалентного качества.

    PBS (рецепт 1) 10x

    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO45.2mM52mM142g/M0.738g3.692g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O  mQ   
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO4x7H2O5.2mM52mM268.1g/M1.394g6.971g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O  mQ   

    PBS (рецепт 2) 10x

    pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.47mM14.7mM136.1g/M0.2g1.0g
    Na2HPO4x7H2O4.29mM42.9mM268.1g/M1.15g5.75g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl2.68mM26.8mM74.56g/M0.2g1.0g
    H2O  mQ   

    PBS (рецепт 3) 10x

    pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO42mM20mM136.1g/M0.272g1.36g
    Na2HPO4x7H2O10mM100mM268.1g/M2.68g13.41g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl2.7mM27mM74.56g/M0.20g1.01g
    H2O  mQ   
    • стерилизовать автоклавированием;
    • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х;
    • pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.

    HBSS (Hanks' balanced salt solution) 10x

    Сбалансированный солевой раствор Хэнкса
    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4оС):
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO40.44mM4.4mM136.1g/M0.06g0.30g
    Na2HPO4x7H2O0.34mM3.4mM268.1g/M0.09g0.45g
    NaHCO34.2mM42mM84.01g/M0.35g1.75g
    NaCl137mM1.37M58.44g/M8.0g40.0g
    KCl5.4mM54mM74.56g/M0.40g2.0g
    CaCl21.3mM13mM110.98g/M0.14g0.70g
    MgCl2x6H2O0.5mM5mM203.30g/M0.10g0.50g
    MgSO4x7H2O0.41mM4.1mM246.48g/M0.10g0.50g
    D-glucose5.0mM50mM198.17g/M1.0g5.0g
    phenol red0.02%0.2%тв.0.2g1.0g
    H2O  mQ   
    • HBSS может быть без Ca2+ и Mg2+ (CMF-HBSS);
    • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х, довести 1M HCl или 1M NaOH;
    • ёмкость с HBSS должна быть плотно закрыта, чтобы предотвратить потерю CO2 и защелачивание;

    Trypsin/EDTA раствор

    (хранить при -20оС не более года)
    Конц.Сток100ml500ml
    trypsin0.25% (w/v)тв.0.25g1.25g
    EDTA0.2% (w/v)тв.0.2g1.0g
    HBSS100ml500ml
    • вместо HBSS можно использовать 0.9% (w/v) NaCl;
    • можно готовить как 10х;
    • EDTA требуется для связывания Ca2+ и Mg2+, которые могут ингибировать действие трипсина;
    • для различных клеточных линий может использоваться различная концентрация трипсина.

    Сыворотка

    (хранить основной сток при -20 оС, рабочее количество (на месяц работы) - при +4оС);

    Плохо переносит замораживание-оттаивание, т.к. это вызывает денатурацию белков.

    Если требуется тепловая инактивация (для инактивации системы комплемента и предотвращения иммунологической реакции против культивируемых клеток) перед первым использованием расплавить и прогреть при 56оС 30' - 1h (вначале прогрева перемешать несколько раз). Подписать, что сыворотка heat inactivated (HI), оставить рабочее количество на +4оС, остальное разаликвотить, быстро заморозить (жидкий азот, сухой лёд) и хранить при -20оС.

    Раствор Версена

    (хранить сток при -20оС, рабочее количество при +4оС).

    Антибиотики

    (хранить при -20оС)

    Плохо переносят замораживание-оттаивание. Перед первым использованием расплавить, разаликвотить, по возможности быстро заморозить.

    Ростовые среды

    (хранить при +4оС).

    Обычно приготовление из сухих сред обходится гораздо дешевле, чем покупка готовых растворов.

    Полная (с сывороткой) среда готовится не более, чем на 1 месяц работы; не надо пытаться достигнуть "абсолютной точности" при добавлении сыворотки, той точности, которая обеспечивает градуированная банка, вполне достаточно.

    Разливать среду по матрасам можно "через" 50ml пробирку (и при разливе никогда не опираться о край "грязных" матрасов).



    Комментарии.

    Общие.

  • Данная методика сделана на основе (i) описания в Cell culture references. In Cell Culture. 1998-99 catalogue Life technologies, p. 9-(3-14); (ii) главы "Basic Techniques for Mammalian Cell Tissue Culture" из "Current Protocols in Cell Biology" и (iii) личного опыта авторов.
  • Здесь приведена общая схема работы с эукариотическими клетками. Оптимальные условия, времена и концентрации для каждой конкретной клеточной линии подбираются опытным путем. На сайтах клеточных коллекций (например, ATCC, DSMZ) можно получить индивидуальную информацию о конкретных линиях и условиях их культивирования.
  • Клеточные линии допускают сравнительно лёгкое замораживание/оттаивание. Это позволяет "вести" их только тогда, когда это действительно нужно. Нет никакого резона в том, чтобы поддерживать клеточную линию в термостате, а не в жидком азоте. Хранение криоконсервированных образцов позволяет избежать потери культуры в результате инфекционного заражения, уменьшить генетические изменения при непрерывном культивировании, избежать старения или окончательной дифференцировки клеток. Старайтесь работать так, чтобы свести количество пассажей к разумному минимуму. Схема работы с новой клеточной линией:
    "разгон" --> "замораживание/проверка" и "проведение экспериментов" --> "сворачивание работы"
  • Во избежание перекрестного загрязнения культур лучше не использовать одни и те же бутыли со средой и реагентами при работе с различными линиями клеток. Кроме того, пипетки, имевшие контакт с флаконами и бутылями с клетками, нельзя повторно использовать для отбора сред из соответствующих емкостей. Подробнее о правилах стерильной работы смотри в тексте "Стерильная работа". Кстати, по поводу антибиотиков: при аккуратной работе можно вполне без них обойтись.
  • Используемые среды и растворы перед добавлением к клеткам должны быть прогреты до температуры 370С (по крайней мере, до NT, но никак не "прямо из холодильника").
  • При пересеве следует отмечать на чашке (матрасе): дату, номер пассажа.
  • О культуральной посуде.
    Обычно культуральная посуда допускает многократное использование (особенно удобно и дёшево, если клетки позволяют растить себя в стеклянной посуде). Если культура одна и та же - просто пересеять на ту же чашку. В противном случае - мыть, стерилизовать ультрафиолетом.
    Сравнение культуральных флаконов (матрасов) и чашек Петри.
    Чашки ПетриМатрасы
    дешевледороже
    полный и удобный доступ к поверхностив зависимости от конструкции; иногда "мёртвые зоны"
    отличный газообменпробки матрасов должны быть закручены неплотно (если это не флаконы с вентилируемыми крышками)
    неудобно, что подписываются крышкинельзя путать неподписанные пробки
    к перевозке не приспособленыможно перевозить
    только CO2-инкубатор (хотя некоторые умельцы запаивают в полиэтиленовый пакет)для некоторых культур можно использовать простой термостат и плотно завинчивающиеся крышки
     чуть свободнее в обращении
  • В каталоге фирмы-изготовителя можно найти информацию о площади ростовой поверхности, общем объеме и рабочем объеме среды для культуральной посуды. Примерные объемы сред и растворов.
    Тип культуральной посудыОбъем ростовой средыОбъем PBS или р-ра Версена при отмывкахОбъем р-ра Версена или трипсин-Версена
    25см2 матрас 60mm чашка Петри5ml2-4ml1ml
    80mm чашка Петри (50см2)7-10ml3-5ml1.5-2ml
    75см2 матрас9-15ml3-5ml1ml

    По пунктам.

    Снятие клеток с культуральных сосудов.
  • Выживаемость клеток в процессе культивирования должна составлять не менее 90%.
  • Клетки пересеваются при достижении ~90-100% монослоя (в конце логарифмической стадии роста). Можно чуть позже (клетки остаются живыми и через ~3 дня после формирования монослоя), но злоупотреблять этим не надо, так как чувствуют они себя при этом плохо и разгоняются потом медленно.
  • Оставить (NB! но это сильно зависит от конкретной культуры):
    ~1/3 для быстрого разгона,
    ~1/10 для "ведения" культуры,
    Доля рассева подбирается для того, чтобы установить удобное и регулярное расписание пересевов (раз или два раза в неделю).
  • п.1.

  • Всегда, когда речь идёт об удалении старой среды или отмывочного раствора, удобнее не выливать, а "отсасывать" с помощью насоса (можно водоструйного или слабого электрического) подключенного через ловушку.
  • п.4.

  • Точное время инкубации определяется визуально. Либо постучать о край матраса (или покачать его), чтобы увидеть, что большинство клеток стало отслаиваться, либо контролировать под микроскопом, что клетки округлились и отцепились от субстрата.
  • п.5.

  • Мы предпочитаем слегка прижимать пипетку ко дну при диспергировании клеток (более сильное дробление, меньше пены).
  • Тип культуры клетокРаствор для отмывкиРаствор для диссоциации
    * большинство постоянных клеточных линий;
    * клетки на ранних пассажах;
    * сильно прикрепляющиеся клетки
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.25% (w/v) трипсин в сбалансированном солевом растворе без кальция и магния
    * постоянные клеточные линии;
    * в случае необходимости сохранить целостность белков клеточной поверхности
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.05% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA
    * слабо прикрепляющиеся эпителиальные клетки;
    * трансформированные фибробласты;
    * первичные культуры, в случае необходимости сохранить целостность поверхностных белков
    HBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)EDTA, глицерин на цитрате натрия;0.04% (w/v) трипсин в 0.53mM EDTA, глицерине, цитрате натрия
    * крепко прикрепляющиеся клеточные линии на первых пассажахHBSS или PBS (без Ca2+, Mg2+)0.25% трипсин на 1mM EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
    * эпителиальные клетки0.5 -1mM EDTA0.5-1mM EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS
    * крепко прикрепляющиеся клетки;
    * эпителиальные клетки;
    * некоторые опухолевые клетки
    0.5-1mM EDTA0.25% трипсин с 1 мМ EDTA
    0.6-2.4 U/ml диспазы в PBS без кальция и магния
    Замораживание клеток
  • Клетки должны быть в логарифмической фазе роста (~70-90% монослой). Перед замораживанием клетки должны быть охарактеризованы и протестированы на наличие бактериального или иного заражения.
  • Лучше через некоторое время высеять одну пробирку, чтобы убедиться, что замораживание прошло нормально.
  • Для заморозки и последующего хранения клеток могут быть использованы среды различного состава.
    (а) Если клетки замораживаются не для роста, а для последующих биохимических исследований, то можно использовать PBS вместо среды с сывороткой.
    (б) На основе среды с сывороткой:
    полная среда плюс 10% глицерина,
    полная среда плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO),
    50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% глицерином,
    50% кондиционированной среды плюс 50% свежей среды с 10% DMSO.
    (в) На основе среды без сыворотки:
    50% кондиционированной среды без сыворотки плюс 50% свежей среды без сыворотки с 7.5% DMSO,
    свежая среда без сыворотки, содержащая 7.5% DMSO и 10% раствор BSA (cell culture grade).
  • непроверенные данные Существует мнение, что клетки лучше замораживать без антибиотиков и не в ростовой среде, а прямо в сыворотке: 85-90% сыворотка и 15-10% DMSO. Причём эти авторы рекомендуют добавлять DMSO к охлаждённой до 0оС клеточной суспензии.
  • непроверенные данные В некоторых лабораториях клетки замораживают не медленно, а быстро: в жидком азоте. И всё нормально. Однако в этом случае, хорошо бы подержать клетки при 4-0оС хотя бы 15', чтобы дать криоконсерванту время проникнуть в клетки.
  • Глицерол, DMSO и медленное охлаждение предотвращают образование кристаллов льда, которые губят клетки.
  • п.11.

  • Требуется значительное время (~ON), чтобы охладить контейнер для замораживания до +4оС, поэтому лучше хранить его в холодильнике/холодной комнате.
  • Дополнения и комментарии людей знающих.

    Вадим Шаров

    Как мыть культуральный пластик.

    Детергентом или хромпиком. Но после хромпика тщательно отмывать. Стерилизовать пластик только ультрофиолетом непрактично - желтеет и портиться, да и не слишком стерильно. Лучше 70% спиртом и чуть чуть на ультрофиолет (30 минут). А лучше (если есть) кобольтовой пушкой.


    Как чистить CO2 инкубатор при заростах.

    Все зависит от СО2 датчика.

    1. Можно медным купоросом или другим веществом с медью, затем вода и 70 % спирт (если датчик это выдерживает). Медный купорос на нержавейку не действует. Можно от купороса не отмывать. Выглядит не очень опрятно, но по опыту и клетки без антибиотиков растут и грибов нет. В поддон к воде добавляем бихромат калия - до желтизны. Воду не в поддон добавляем а в корытце или другую емкость.
    2. Формалином с детергентом.
    3. Азид натрия лучше не использовать. И себя отравишь и если подсушится - будет БАХ.

    Можно ли модифицировать поверхнось дешёвого пластика, чтобы использовать его для клеточных культур.

    Вообще полчаса в жестком хромпике и даже старые иммунологические платы связывают белки как новые, а клетки растут как звери. Только надо много раз полоскать после хромпика.


    Теперь о заморозке.

    Лучше чем замораживание в сыворотке (90%) DMSO (10%) не знаю. С фибробластами, даже первичными после такого замораживания не надо мучаться с откруткой от криопротектора.


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100