Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессия белков > Проверка взаимодействия двух белков.

Проверка взаимодействия двух белков на глютатион-сефарозе.

Несложный метод для проверки взаимодействия двух белков in vitro.

  1. Отмыть 50µl глютатион-сефарозы два раза по 500µl LB;
  2. На последней отмывке разделить на две части, убрать супер;
  3. Поставить связывание:
     глютатион-сефарозаодна часть из п.2
     GST30µg
     LBдо 600µl;
  4. Поставить связывание:
     глютатион-сефарозаодна часть из п.2
     GST-proteinA50-100µg
     LBдо 600µl;
  5. Инкубировать на ротаторе 30', RT;
  6. Открутить, сохранить 10µl супера из каждой пробирки, остальной супер выкинуть;
  7. Отмыть 600mkl LB;
  8. Отмыть 600mkl IP100;
  9. Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
  10. Отмыть 600mkl IP100;
  11. Поставить взаимодействие: (негативный контроль)
     смола со связанным белком GST 
     ProteinB20-100µg
     IP100до 600µl;
  12. Поставить взаимодействие: (эксперимент)
     смола со связанным белком GST-ProteinA 
     ProteinB20-100µg
     IP100до 600µl;
  13. Инкубировать на ротаторе 1.5h, RT;
  14. Открутить, сохранить 10µl супера из каждой пробирки, остальной супер выкинуть;
  15. Отмыть 600mkl IP100;
  16. Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
  17. Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
  18. Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
  19. Отмыть 600mkl IP100;
  20. Аккуратно удалить остатки жидкости из смолы;
  21. К смоле добавить 15µl 2x краски для нанесения;
  22. К образцам из пп. 6, 14 добавить по 10µl 2x краски для нанесения;
  23. Прокипятить и нанести по 10µl всех образцов на PAAG. Элюции эксперимента и негативного контроля из п.21 нанести на соседние дорожки;
  24. В элюции негативного контроля не должно быть белка ProteinB, а толко GST;
  25. В элюции эксперимента должны быть белки ProteinB и GST-ProteinA;

    Растворы.

    Глютатион-сефароза

     Glutathione Sepharose 4B - Pharmacia Biotech, Code No. 17-0756-01

    LB

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris HCl pH 8.025mM1M1.25ml2.5ml
    NaCl100mM5M1ml2ml
    EDTA5mM0.5M0.5ml1ml
    H2O mQ47.25ml94.5ml

    IP100

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris HCl pH 8.050mM1M2.5ml5ml
    NaCl100mM5M1ml2ml
    MgCl25mM1M0.25ml0.5ml
    Глицерин20%100%10ml20ml
    Triton X1000.1%10%0.5ml1ml
    DTT0.5mM1M25µl50µl
    H2O mQ35.73ml71.45ml

    IP300

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris HCl pH 8.050mM1M2.5ml5ml
    NaCl300mM5M3ml6ml
    MgCl25mM1M0.25ml0.5ml
    Глицерин20%100%10ml20ml
    Triton X1000.1%10%0.5ml1ml
    DTT0.5mM1M25µl50µl
    H2O mQ33.73ml67.45ml

    IP500

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris HCl pH 8.050mM1M2.5ml5ml
    NaCl500mM5M5ml10ml
    MgCl25mM1M0.25ml0.5ml
    Глицерин20%100%10ml20ml
    Triton X1000.1%10%0.5ml1ml
    DTT0.5mM1M25µl50µl
    H2O mQ31.73ml63.45ml

    IP1000

    Конц.Сток50ml100ml
    Tris HCl pH 8.050mM1M2.5ml5ml
    NaCl1M5M10ml20ml
    MgCl25mM1M0.25ml0.5ml
    Глицерин20%100%10ml20ml
    Triton X1000.1%10%0.5ml1ml
    DTT0.5mM1M25µl50µl
    H2O mQ26.73ml53.45ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Несложный метод для проверки взаимодействия двух белков in vitro. Мы используем этот протокол для подтверждения взаимодействия белков, найденных в двугибридном скрининге.
  • Список сокращений:
    GST - глютатион трансфераза, этот белок способен связываться с глютатион-сефарозой.
    ProteinA, ProteinB - белки между которыми проверяется взаимодействие.
    GST-ProteinA - фьюжн GST и ProteinA
  • Перед началом зксперимента следует провести экспрессию и очистку трех белков: GST, GST-ProteinA, ProteinB. Для экспрессии мы используем вектор pGEX5X-1.
  • Если детектировать ProteinB в элюции с помощью вестерна, то количество всех белков можно уменьшить раз в 50 или наносить на форез небольшую часть элюции.
  • Вместо IP500 можно использовать для отмывок IP300 или IP1000.
    IP300 - это более слабые условия отмывки, IP1000 - более сильные.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100