Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессия белков > His6-меченные белки.

Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке (e(y)2/mouse).


    Приготовление стоковой культуры.

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%};
  2. отобрать 2-3 индивидуальные колонии, поместить их в 5ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках;
  3. растить 200-300rpm, 30(37)oC, ON;
  4. из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml;
  5. к оставшимся частям культуры добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 500 µl в подписанных 1.5ml ЦФ-пробирках, заморозить в жидком азоте, хранить при -70oC;
  6. аликвоты из п.4 2х промыть 1.0ml 2xYT;
  7. ресуспензировать в 2ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
  8. отобрать по 200 µl (не индуцированный контроль);
  9. остальная часть 200-300rpm, 37oC, ~5h;
  10. отобрать по 200 µl (индуцированный контроль);
  11. проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе (15% разрешающий гель);
  12. Препаративная культура.

  13. разморозить аликвоту из п.5, перенести её в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере двух 2L колбах;
  14. 200-300rpm, 37oC, до OD600=0.6-0.8 (но ниже 1.0!);
  15. ЦФ 4krpm, 10', NT;
  16. 2x промыть клетки 100ml 2xYT (ЦФ 4krpm, 10', NT);
  17. ресуспензировать в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
  18. optional
  19. отобрать 1ml (не индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

  20. 200-300rpm, 37oC, 5h;
  21. optional
  22. отобрать 1ml (индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

  23. ресуспензировать клетки в ~100ml Lysis buffer (LB), перенести в 50ml центрифужные пробирки;
  24. ЦФ 4krpm, ~5', 4oC;
  25. сбросить супернатант, взвесить осадки, ресуспензировать их в LB из расчёта 4ml на 1g осадка;
  26. заморозить в жидком азоте, хранить при -70oС;
  27. проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе;
  28. Приготовление осветлённого лизата.

  29. разморозить клетки во льду ~15';
  30. добавить лизоцим до 1mg/ml, 30', 0oС;
  31. озвучить во льду (6х 200-300W с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения между импульсами);
  32. отобрать 0.1ml (контроль перед центрифугированием);
  33. ЦФ 10krpm, ~30', 4oC;
  34. забрать супернатант, отобрать 0.5ml для определения количества e(y)2/mouse белка, остальное заморозить в жидком азоте, хранить при -70oС;
  35. Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы.

  36. сполоснуть 0.1ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 0.5ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
  37. поставить аналитическую адсорбцию:
    1. 10 µl 50% Ni-NTA + 10 µl супернатанта из п.30 + 150 µl LB;
    2. 10 µl 50% Ni-NTA + 40 µl супернатанта из п.30 + 120 µl LB;
    3. 10 µl 50% Ni-NTA + 160 µl супернатанта из п.30;
  38. смешивать 1h при +4oC (холодная комната) на роторном смесителе;
  39. снять супернатант, 2х сполоснуть 0.5ml WB, снять белок с агарозы в 50 µl 100mM EDTA;
    1. сравнить выход белка окрашиванием на Whatman 3MM, нанеся 2х кратные разведения;
    2. определить концентрации белка в элюциях (а)-(в) с помощью Bicinchoninic acid protein assay kit (Но, внимание!!! Нельзя использовать больше, чем 1 µl, т.к. 10mM EDTA - предельная допустимая концентрация для этой процедуры);
  40. рассчитать, какой объём супернатанта можно очистить на 2ml 50% Ni-NTA и какое количество белка ожидается с этого получить;
  41. Препаративная очистка.

    Нанесение на колонку.

  42. сполоснуть 2ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 4ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
  43. поставить адсорбцию:
  44. 2ml 50% Ni-NTA агарозы
    "?"ml супернатанта (из расчёта п.33)
    "?"ml LB (чтобы сохранялась пропорция п.29);

  45. 1h при +4oC (холодная комната) на роторном смесителе;
  46. нанести лизат на 1ml Qiagen-колонку, собрать то, что прошло сквозь колонку;
  47. лучше прикрыть Ni-NTA агарозу в колонке верхним штифтом;
  48. промыть колонку 10ml LB, собрать то, что прошло сквозь колонку;
  49. промыть колонку 10ml WB, забрать последний ~1ml из тех, что прошли сквозь колонку;
  50. В протоколе не представлена оптимизация способа элюции с колонки. Её нужно проводить при первой очистке любого белка. При этом белок элюируется градиентом концентрации имидазола (или pH), фракции анализируются на PAAG и подбирается оптимальный состав WB и EB.

    Элюция имидазолом.

  51. промыть колонку 3ml I-WB, собирать фракции по 0.5ml;
  52. элюировать белок 3ml I-EB, собирать фракции по 0.5ml;
  53. Элюция кислым буфером.

  54. промыть колонку 3ml A-WB, собирать фракции по 0.5ml;
  55. элюировать белок 3ml A-EB, собирать фракции по 0.5ml;
  56. проанализировать на форезе ход очистки, объединить фракции элюата, содержащие основное количество рекомбинантного белка, определить выход белка;
  57. если не требуется вносить коррективы - вымыть Ni-NTA агарозу из колонки и провести очистку оставшегося осветлённого лизата;
  58. определить количество и качество белка в индивидуальных раундах очистки, подписать пробирки, заморозить в ж. азоте, хранить на -70oС.
  59. регенерировать Ni-NTA агарозную колонку, подписать когда и для очистки какого белка она использовалась, хранить на +4oС.
  60. Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки).

  61. промыть колонку 4ml RB;
  62. промыть колонку 5ml H2O;
  63. промыть колонку 3ml 2% SDS;
  64. промыть колонку 1ml 25% EtOH;
  65. промыть колонку 1ml 50% EtOH;
  66. промыть колонку 1ml 75% EtOH;
  67. промыть колонку 5ml 100% EtOH;
  68. промыть колонку 1ml 75% EtOH;
  69. промыть колонку 1ml 50% EtOH;
  70. промыть колонку 1ml 25% EtOH;
  71. промыть колонку 1ml H2O;
  72. промыть колонку 5ml 100mM EDTA, pH8.0;
  73. тщательно промыть колонку 20ml H2O;
  74. перезарядить колонку 2ml 100mM NiSO4
  75. промыть колонку 2ml H2O;
  76. промыть колонку 2ml 25% EtOH;
  77. заполнить колонку до половины 25% EtOH;
  78. хранить при +4oС.

    Растворы.

    Lysis buffer (LB)

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH8.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH8.0*20mM1M1.0ml
    H2O mQ43.5ml

    Wash buffer (WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*20mM1M1.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ38.5ml

    Imidazole wash buffer (I-WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*150mM1M7.5ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ32.0ml

    Imidazole elution buffer (I-EB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH6.050mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Imidasole, pH6.0*450mM1M22.5ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ17.0ml

    * Имидазол обладает значительной буферной ёмкостью, поэтому нужно заранее доводить его pH.

    Acid wash buffer (A-WB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH5.350mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ39.5ml

    Acid elution buffer (A-EB)

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaxH3-xPO4, pH4.550mM1M2.5ml
    NaCl300mM5M3.0ml
    Glycerol10%100%5ml
    6.25g

    H2O mQ39.5ml

    Regeneration buffer

    Конц.Сток50ml
    Guanidine HCl6M95.53g/M28.66g
    Acetic acid0.2M17.4M0.57ml
    H2O mQ  

    NiSO4 1M

    Конц.Сток10ml
    NiSO46H2O1M262.8g/M2.62g
    H2O mQ  


    Комментарии.

    Общие.

  • Как и любой другой белок, ey2 нужно чистить при +4oС, т.е. в холодной комнате.
  • По пунктам.

    п. 1-11.

  • Клон-продуцент может быть нестабилен, поэтому необходим этап селекции.
  • п. 1.

  • 2% глюкоза выступает здесь как репрессор lac промотора (под контролем которого находится экспрессируемый ген). Катаболитная репрессия - хоть и очень простой метод, но вполне действенный: на чашках с 2% глюкозой сине-белый тест не работает.
  • п. 3.

  • Инкубация при 30oС - чтобы культура не перерастала.
  • п. 6.

  • Промывка 2xYT, чтобы перед индукцией избавиться от глюкозы. 2х промывка проводится следующим образом:
    1. поместить 1ml культуры в стерильную 1.5ml ЦФ-пробирку;
    2. ЦФ либо 2' при 6krpm (в микроцентрифуге с регулируемой скоростью вращения), либо 10'' при 14krpm;
    3. убрать супернатант, бактерии ресуспензировать на вортексе в 1.0ml 2xYT;
    4. повторить: п.2, 3;

    п. 8, 10.

  • Отобранные 200 µl осадить на ЦФ (10-30'') и ресуспензировать в 20 µl {1х буфера для внесения}. Чтобы не образовывалось трудно растворимых комков лучше вначале ресуспензировать в 10 µl H2O, а потом добавить 10 µl 2х буфера.
  • п. 9, 18.

  • Время индукции можно увеличить в ~два раза, но это не приведёт к увеличению количества рекомбинантного белка.
  • п. 11.

  • Чтобы получить нормальную картинку достаточно взять 3 µl на 2.5х0.75mm2 форезную ячейку. Но, в первый раз мы бы посоветовали наносить образцы на гель тремя блоками:
  • 3х количество => 9 µl;
    1х количество => 3 µl;
    0.3х количество => 1 µl.

    В этом случае вы наверняка получите хорошую картинку хотя бы на одном из блоков. Количество материала, которое даст приемлемую картинку на форезе можно так же оценить с помощью предварительной окраски серийных разведений на Whatman 3MM.

  • На форезе вы должны увидеть жирную полосу (~20% от всего белка на дорожке) в районе 10kDa.
  • п. 15.

  • Отмывку проводить в металлических ЦФ стаканах. Перед этим стаканы и пластиковые крышки тщательно вымыть, протереть спиртом и высушить под UV(стерилизация). Ресуспензирование и т.п. проводить на столе (не под ламинаром), но нужно делать это чисто.
  • п. 22.

  • Сбрасывать супернатант в два этапа: сначала слить, провести повторное центрифугирование ~1-2', остатки жидкости отсосать.
  • п. 25.

  • Можно размораживать и в бане при комнатной температуре, НО!!! С непрерывным перемешиванием и перенести в ледяную баню, когда в пробирке ещё останется ~10% льда.
  • п. 27.

  • Раствор должен стать слабо вязким после озвучивания.
  • п. 34.

  • При споласкивании Ni-NTA её можно осаждать низкоскоростным центрифугированием:
  • для микроцентрифуги - 30'' при 3krpm;
    для препаративной центрифуги - 2' при 2krpm.

    п. 37.

  • В пределах ёмкости Ni-NTA агарозы количество полученного белка должно увеличиваться пропорционально исходному количеству.
  • Только для ориентировки!: у нас получалось ~80 µl супернатанта на 10 µl 50% Ni-NTA агарозы.
  • п. 37.

  • Предварительно залить в колонку ~5ml LB, дать стечь.
  • п. 41.

  • Верхний штифт вводить либо перевернутым желтым типом, либо обрезанной 1ml пипеткой.
  • п. 48.

  • На форез нужно нанести
  • а) материал из пунктов 28, 30, 37, 39, 40,
    б) равные объёмы (~1 µl) из фракций пунктов 41, 42 или 43,44.

    Объёмы материала из п. 28, 30, 37, 39, 40 нужно скорректировать с учётом разбавления в п.35.
    Например, если 10 µl 50% Ni-NTA агарозы связывают количественно рекомбинантный белок из 80 µl супернатанта: адсорбция:

    2ml 50% Ni-NTA агарозы
    16ml супернатанта
    16ml LB

    => объёмы из п. 37, 39, 40 в 2.1 раза больше, чем из п. 28, 30.

    п. 49.

  • Для экономии времени в следующих раундах, очистку можно контролировать не на форезе, а по окрашиванию аликвот на Whatman 3MM.
  • Рекомбинантный белок, очищенный в каждом раунде нужно объединить в отдельной пробирке, для каждой определить концентрацию белка (Bicinch. kit) и проконтролировать его качество на отдельной дорожке PAAG. Лишь когда качество индивидуальных очисток будет проконтролировано на форезе, можно объединить материал в одной пробирке.

  • Экспрессирующая конструкция.

    Открытая рамка считывания мышиного e(y)2 гена клонирована по BamHI-HindIII сайтам в pQE30 вектор (Qiagen); аминокислотная последовательность рекомбинантного белка:

    MOUSE E(Y)2 PROTEIN, RECOMBINANT,
    EXPRESSED IN E.COLY AS 6HIS FUSION
    SEQUENCE 113 AA; 12927 MW;

    MRGSHHHHHH GSMVVSKMNK DAQMRAAINQ KLIETGERER LKELLRAKLI ECGWKDQLKA
    HCKEVIKEKG LEHVTVDDLV AEITPKGRAL VPDSVKKELL QRIRTFLAQH ASL


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100