Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессия белков > Pfu полимераза.

Очистка Pfu полимеразы (клон pETpfu в BL21(DE3)pLysS).


    Комментарии.

    Общие.

  • Экспрессирующая конструкция описана в "Protein expression and purification, 11, 179-84 (1997) Expression in Escherichia coli of the Thermostable DNA Polymerase from Pyrococcus furisous. C. Lu and H.P. Erickson".
  • Индукция и очистка проводятся точно так же, как при очистке Taq pol "Очистка Taq полимеразы (клон pTp4).". Отличия:
    1. вместо Amp используется смесь Carbenicillin 200 µg/ml + Chloramphenicol 34 µg/ml;
    2. возможное время индукции 4h-ON;
    3. приятным отличием в случае Pfu pol. является то, что преципитат при тепловой обработке п.36 получается кашеобразным: бактериальная DNA в супернатант не переходит как бы вы не обращались с раствором в пп.34-36;
    4. на 30ml колонку можно наносить осветлённый лизат, содержащий ~15ku (0.5ku на 1ml колонки);
  • В наших руках получался выход ~30,000u на литр культуры (но, возможно, что различие со статьёй в 2.7 раз связано с использованием Taq-полимеразного буфера для оценки активности "Определение активности полимеразы.").

    Растворы.

    2xYT, Cb/Cam, Glucose 2%

    (готовить перед использованием):

    Конц.Сток1L
    2xYT~1х950ml
    Glucose2%40%50ml
    Carbenicillin200 µg/ml100mg/ml2ml
    Chloramphenicol34 µg/ml34mg/ml1ml

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100