Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Экспрессия белков > Определение и протокол определения активности.

Определение активности полимеразы.


    Заранее.

  1. приготовить смесь для определения активности:
  2. Конц.Сток 80µl
    Буфер 10х 8µl
    MgCl2 2.5mM 25mM 10µl
    dNTP’s(low-dA)* 1x 50x 2.0µl
    Primer** 0.3 µM 10 µM 3µl (30pmol)
    Матрица ss pSK(+) 78µg/ml ??? ??? (8pmol) 
    H2O mQ   
  3. провести отжиг в PCR машине (если в 200 µl пробирках, то разаликвотить так, чтобы получилось не более 100 µl на пробирку):
  4. T = 93oC, 3';
    T = 37oC, 15';

    при работе держать в ледяной бане, хранить при -20oC (размораживать так, чтобы температура не поднималась выше NT);

    Перед использованием.

  5. рассчитать необходимое количество смеси для определения активности (4 (или 2) µl на одну реакцию);
  6. добавить меченный a[32P]dATP из расчета > 5 µCi на 80 µl смеси;
  7. Реакция.

  8. приготовить разведения Taq pol в Dilution Buffer;
  9. к 4(2) µl смеси добавить 1(0.5) µl раствора Taq полимеразы (в ледяной бане!!!), смешать, затем (лучше в PCR машине):
  10. T=37oC, 1';
    T=72oC, 15';
    T=0-4oC, по крайней мере 2';

  11. поместить в лёд, не вынимая изо льда добавить к каждой пробирке 1 µl 0.1M EDTA;
  12. определить процент включения (см. "Определение процента включения.");
  13. включение (теоретическое) 100% соответствует концентрации полимеразы 0.2u/µl (соответственно, например 3% - 0.006u/µl)

    Растворы.

    dNTP’s(low-dA)

    если меченный дезоксинуклеотидтрифосфат dATP;

    Конц.Сток40 µl200 µl
    d(G,C,T)TP10mM100mMпо 4 µlпо 20 µl3x
    dATP2.5mM100mM1 µl5 µl
    H2O mQ27 µl135 µl

    Primer

    для ss pSK(+) в качестве праймера можно использовать U-olig (#0010) или T7 primer (#0390);

    10х Буфер

    (хранить при 4oС) - это тот же буфер, что используется в PCR:

    Конц.Сток25ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M2.5ml
    KCl0.5M2M6.25ml
    Triton X-1001%10%2.5ml
    H2O mQ13.75ml

    Dilution buffer

    (хранить при +4--20oС):

    Конц.Сток25ml
    Буфер1x10x2.5ml
    BSA100 µg/ml10mg/ml0.25ml
    H2O mQ22.25ml


    Комментарии.

    Общие.

  • 1u активности определяется как такое количество фермента, которое включает 10nmol (всех четырёх) dNTP’s в кислотонерастворимую фракцию за 30' при 72oC. Обычно в качестве матрицы используется активизированная calf thymus DNA, но в наших руках она даёт неудобно низкий процент включения.
  • Внимание!!! Ни в коем случае нельзя судить об активности по одному измерению, т.к. слишком большое количество фермента ингибирует реакцию.
  • При использовании приведённого протокола % включения не превышает 50%, а судить об активности фермента можно лишь по разведениям, которые дают не более или порядка 10% включения (иначе будет получена заниженная активность).
  • По пунктам.

    п.7.

  • На самом деле мы EDTA не добавляем. Просто держим пробирки во льду и работаем быстро.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100