Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Окрашивание гелей Кумасси R250 с метанолом.

Окрашивание белковых гелей Coomassie R250 с метанолом.

Метод наименее чувствительный (по сравнению с серебряным окрашиванием или окрашиванием Zn/имидазолом). Его делают популярным два сравнительных преимущества: (i) он проще и несравненно дешевле, чем серебряное окрашивание; (ii) в отличие от окрашивания Zn/имидазолом, гель можно высушить и сохранить.

  1. поместить гель в ~ 5V Staining solution на ~ 4h (лучше с покачиванием);
  2. убрать Staining solution (его можно использовать несколько раз);
  3. быстро сполоснуть гель H2O;
  4. отмывать в двух сменах Destaining solution:
  5. Destaining solution I ~ 20'-2h (в зависимости от температуры),
    Destaining solution II ~20'-2h;
     

    альтернативный метод отмывки (Дмитрий Жарков)
  6. гель кладется в широкую стеклянную посудинку с холодной водой (200-300 ml), и кипятится ~5' (или до желаемой прозрачности);
     
  7. гель либо фотографировать, либо сушить.

    Растворы.

    Staining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):

    Конц.Сток100ml
    Coomassie Blue R2500.25тв.0.25g
    Метанол45%100%45ml
    H2O45%mQ45ml
    Уксусная к-та10%ледяная10ml
  • Растворять краситель на бактериальном шейкере, затем фильтровать через бумажный фильтр.
  • Destaining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):
    двухфазна система, состоящая на 10-20% из бутанола и на 90-80% из:

    Конц.Сток100ml
    Уксусная к-та5%ледяная5ml
    H2O95%mQ95ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Чувствительность 0.1-1.0µg белка на бэнд.
  • Метод не очень чувствителен, и вполне возможно работать с гелем без перчаток. Но мы не советуем этого делать, если Вам не хочется, чтобы в транспорте косились на Ваши синие пальцы.
  • Непроверенная информация При окрашивании фон возникает из-за SDS и буфера, если их предварительно отмыть фон получится существенно слабее:
  • * отмыть гель в 2х сменах большого объёма 5mM HCl (каждая смена ~1h);
    * далее - окраска как обычно.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Скорость окрашивания зависит от температуры. При 60-65oС достаточно <1h. Внимание (!!!) горячее окрашивание можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.
  • п. 4.

  • Отмывка идет существенно быстрее при повышенной температуре. Но(!) при этом за ней нужно следить, иначе можно смыть не только фон, но и специфический сигнал (если всё же не уследили, окрашивание можно повторить). Внимание (!!!) горячую отмывку можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.
  • Бутанол вытягивает краситель из водной фазы. Двухфазный Destaining solution гораздо удобнее, чем однофазный или двухфазный с поглотителями. Отмывка существенно быстрее, раствор служит гораздо дольше.
  • Destaining solutions I и II различаются только названиями. Destaining solution I применяется первым (предварительная отмывка), он более грязный. Destaining solution II (финальная отмывка) - чище. Когда бутанол в Destaining solution I становится совсем грязным, его выбрасывают (удобнее отсосать вакуумным насосом); на его место переливают бутанол из Destaining solution II, который, в свою очередь, заменяют свежим бутанолом (или просто переобозначают раствор "II" в "I").
  • п. 5.

  • Удобство в том, что без уксусной, без метанола, и гораздо быстрее. Результат - как при стандартной отмывке, может, фон чуть погуще. Растрескивание при сушке обычное. Мы так отмываем уже года два, оригинальная ссылка на: G.Hervieu. A quick and safe method for destaining Coomassie-Blue-stained protein gels. Technical Tips Online.
  • п. 6.

  • Обычно гель сушат (т.к., если человек умеет фотографировать, то лучше пользоваться Zn/имдазол методом: он существенно быстрее и чувствительнее).
  • Есть два пути решения проблемы растрескивания гелей при сушке (обычно это касается только высокопроцентных гелей):
    1. инкубировать гель перед сушкой или ~1h в 20% глицерине, или ~30' в ацетоне.
    2. использовать более мощный вакуумный насос.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100