Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > PAAG в неденатурирующих условиях.

PAAG электрофорез нативных белков.

Алексей Колесниченко,
Сибирский институт физиологии и биохимии растений



    Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля размером 70х80х1 mm3, используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN II Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США).

    Стеклянные пластины, одна из которых несколько длиннее другой (83х102 и 73х102 mm2), отделяли друг от друга с помощью прокладок из органического стекла толщиной 1 mm и вставляли в устройство для заливки геля, прилагаемое к прибору для электрофореза. В просвет между стеклянными пластинами заливали раствор мелкопористого полиакриламидного геля, а после его полимеризации заливали крупнопористый гель. В последний погружали зубчатый шаблон для формирования карманов для нанесения белковых проб.

    Верхним электродным буфером служил трис-глицин, pН 8.3 (25 mM Трис и 192 mM глицин) с добавлением 0.01% SDS. Нижний электродный буфер имел такой же состав без SDS. Рабочий гель (7%) полимеризовали в 375 mM Трис-НСl буфере с добавлением 0.01% SDS, рН 8.8, а формирующий гель в 62.5 mM Трис-НСl буфере, рН 6.8. Для того, чтобы полимеризация проходила равномерно, полимеризующиеся блоки охлаждали. Для создания ровной верхней границы разделяющего геля на него наслаивали изобутанол, насыщенный водой.

    Электрофорез проводили, используя электрофоретическую ячейку прибора Mini-PROTEAN II. Стеклянные блоки прижимали специальными зажимами к передней части катодного отсека так, чтобы меньшая пластина была на уровне выреза в передней стенке прибора, а большая пластина была выше этого выреза. В электродный резервуар наливали верхний электродный буфер. Пластины опускали в нижний электродный буфер.

    Анализируемые белки растворяли в буфере, состоящем из Трис-НСl (62.5 mM, рН 6.8), 1% ß-меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,001% бромфенолового синего, и наносили на гель, предварительно выровняв концентрации, не более 25-30 µg белка на трек (20-25 µl образца). Первые полчаса, когда образцы входили в гель, устанавливали силу тока 50 mA на блок. Далее электрофорез проводили при постоянной силе тока 80 mA три часа, пока свидетель (бромфеноловый синий) не доходил до конца гелевого блока. После окончания электрофореза стеклянные пластины вынимали из прибора, и освободившийся гель помещали в камеру для окрашивания или использовали для переноса на нитроцеллюлозную мембрану.



    Комментарии.

    • Методика применялась в нашей лаборатории в течении длительного времени.
    • Сдвиг заряда белков за счет присутствия в буферах и геле низкой концентрации SDS позволяет добиваться значительного сокращения времени проведения электрофореза (4 часа против 48 часов по сравнению с электрофорезом в градиенте плотности ПААГ) и значительно улучшает картинку при последующем блоттинге, при этом при данной концентрации SDS (ее все-же необходимо подбирать в зависимости от исследуемого образца) не наблюдается изменения белкового спектра за счет развала белков на субъединицы.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100