Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Тестирование антител.

Dot-blot для определения рабочей концентрации антител.

При оптимальном разведении чувствительность антител максимальна, но в тоже время они ещё не дают слишком высокого фона на BSA.

    Подготовка мембраны.

    Нанесение образцов на мембрану
  1. вырезать мембрану нужного размера (по одному блоту для каждого разведения первичных антител);
  2. отметить карандашом положение образцов, так, чтобы минимальное расстояние между ними было ~1cm;
  3. смочить мембрану сначала в mQ, затем в PBS;
  4. приготовить серийные разведения белка в BSA 50ng/µl/PBS;
  5. нанести по 1-2.5µl образцов на мембрану, не касаясь её типом;
  6. подсушить мембрану;
  7. мембрану либо использовать сразу, либо хранить при 2-80С, завернутой в Saran Wrap, в течение 3 месяцев.
  8. Иммунодетекция.

  9. "забивка" мембраны 1h NT на качалке;
  10. отмывка 1x15' и 2х5'в 0.1%Tween/PBS NT;
  11. приготовить несколько разведений первичных антител: 1:100, 1:250, 1:500;
  12. инкубировать 1 блот с каждым разведением 1h NT;
  13. отмыть (п.9);
  14. инкубировать со вторичными антителами 1h NT;
  15. отмыть (п.9);
  16. далее - детектировать, используя ЕCL реагенты.

    Пример: разведения рекомбинантного белка (С=4µg/µl):

  1. 1µl белка + 199µl BSA (0.1µg/µl) = 20 ng/µl (2.5µl на dot)
  2. 10µl (из п.1) + 10 µl BSA = 10 ng/µl (1µl )
  3. 4 µl (из п.2) + 16 µl BSA = 2 ng/µl (1µl)
  4. 4 µl (из п.3) + 16 µl BSA = 0.4 ng/µl (1µl)

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100