Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Western.

Western blotting.

Все в перчатках! (Можно reusable).

    Сухой перенос на трансблоттере.

  1. отрезать концентрирующий гель, ненужные участки геля, правый верхний угол;
  2. качать гель в TS 10' при NT;
  3. приготовить мембрану (на 4-6mm шире и длиннее геля) и 6 таких же кусков Whatman 3MM (если у геля обрезан угол, у мембраны и ватмана обрезать тоже);
  4. мембрану смочить 5' в H2O, затем 5' в TS (PVDF мембрану прежде всего смочить в метаноле 15'');
  5. ватман смочить в TS;
  6. приготовить сэндвич показанный на рисунке (аккуратно прокатывать пипеткой, чтобы выгнать пузыри):

    Электроперенос сухой

  1. перенос 25', выставив ограничение по току Amax=2mA/cm2(например, для геля размером 10х10cm2xAmax=200mA).
  2. после переноса

  3. снять крышку, верхние куски Whatman, отметить на фильтре сторону, на которую шел перенос (сторона P);
  4. сполоснуть фильтр в 1хPBS, хранить:
  5. * ON при NT (сухим, завернутым в фильтровалку);
    * по крайней мере 2 недели при +4oC (влажным, завёрнутым в SaranWrap или в ванночке с PBS);

  6. пластины прибора после переноса промокнуть фильтровалкой, сполоснуть дистиллированной водой из промывалки, вытереть полотенцем. Дать высохнуть, закрыть;
  7. Окрашивание белков на фильтре.

  8. после переноса белки на мембране можно окрасить (лишь окрашивание Ponceau S обратимо и полностью совместимо с со всеми методами иммуноокрашивания);
  9. Характеристики белковых красителей.

    Способ
    окраски
    *NCNP Окрашивание
    Ponceau S 1-2µg + - + обратимое
    Amido Black 1.5µg + - + постоянное, низкий фон
    Comassie blue 1.5µg + - + постоянное, высокий фон
    India ink 100ng + - + постоянное
    Biotin-avidin 30ng + + + постоянное, бледнеет со временем
    Colloidal gold 3ng + - + постоянное

    * - Чувствительность
    NC - Нитроцеллюлоза
    N - Нейлон
    P - PVDF

  10. если мембрана была высушена - аккуратно положить её на поверхность H2O, дать промокнуть под действием капиллярных сил и утопить на 3-5';
  11. перенести в окрашивающий раствор PSS, 5-10' с покачиванием;
  12. после появления картинки сполоснуть мембрану в нескольких сменах H2O;
  13. положение маркера отметить водоустойчивыми чернилами/карандашом.
  14. Гибридизация.

  15. забивка в HB на качалке 40' NT (или +4oС ON);
  16. гибридизация с "I"а/т в HB в гибридайзере 2h 26oC (или +4oС ON);
  17. заморозить раствор для I-гибридизации;
  18. отмывка 3х 5' в WB на качалке NT;
  19. гибридизация со "II"а/т в HB в гибридайзере 30-50' 26oC;
  20. заморозить раствор для II-гибридизации;
  21. отмывка, как в п.19.
  22. Проявление Westerna (ECL-kit).

  23. мембрану вынуть из отмывочного раствора, промокнуть на фильтровалке, положить на Saran Wrap (сторона Р - вверх);
  24. смешать равные объёмы растворов 1 и 2 (приблизительно по 0.5-1.0ml, в зависимости от размера фильтра), нанести на фильтр (можно пульверизатором);
  25. 1' NT (следить, чтобы был покрыт весь фильтр);
  26. если раствора много, приподнять фильтр, дать лишней жидкости стечь с угла;
  27. а) Если свежие ECL реагенты и хорошие а/т:
  28. * подготовить заранее пленку, кассету, фиксаж и проявитель;
    * мембрану положить на стекло, стороной Р вверх, сверху покрыть Saran Wrap, отнести в темную комнату, положить на стол.;
    * рентгеновскую плёнку наложить сверху, прижать; сделать несколько экспозиций: 5'', 30'', 60''; проявить; оценить автограф, если слишком сильный или слабый, повторить экспозицию, но уже с откорректированным временем.

    б) Если ECL реагенты старые и/или плохие а/т:

    в этом случае требуется большое время экспозиции, поэтому:

    * фильтр завернуть в Saran Wrap, заложить на экспозицию в кассете на 3';
    * перезаложить (на вторую плёнку);
    * первую пленку проявить, по ней оценить, сколько времени нужно экспонировать вторую (но >30' бессмысленно).

    Хранение фильтра после проявления.

  29. Хранить влажными (в 1хPBS):
  30. (1) +4oС на стекле, покрытым Saran Wrap, до 2-3 недель;
    (2) +4oС в растворе 1х PBS, до 1-2 недель - пока не прорастёт;
    (3) Непроверенная информация +4oС в растворе 1х PBS + 0.005%NaN3, >4 месяцев;
    (4) долговременное хранение: завернуть в Saran Wrap, запаять в полиэтиленовый пакет, (optional - проложить между стёклами), хранить на -70oС.

    Отшпаривание от а/т для повторной гибридизации.

    Не всегда нужно, т.к. обычно и без него можно разобраться.
    (и для NC, и для PVDF):

  31. 30' 50oС в SB;
  32. сполоснуть фильтр 1хPBS.
  33. Хранение а/т.

    На этот счет существуют разные мнения:

    1. Некоторые замораживают в жидком азоте небольшие аликвотами, хранят на -70oС, размораживают 1 раз и далее хранят при +4oС. По нашему опыту на +4oС лучше не хранить более месяца.
    2. Другие хранят на -20oС, размораживают и замораживают при каждом использовании.
    3. На некоторые фирменных а/т есть указания как с ними обращаться. Но в любом случае слишком большие фасовки лучше разаликвотить и часть заморозить.

    Растворы.

    PBS

    pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4oС):

    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO45.2mM52mM142g/M0.738g3.692g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O mQ    
    1x10xСток100ml500ml
    KH2PO41.7mM17mM136.1g/M0.231g1.157g
    Na2HPO4x7H2O5.2mM52mM268.1g/M1.394g6.971g
    NaCl150mM1.5M58.44g/M8.77g43.83g
    H2O mQ    
  • стерилизовать автоклавированием;
  • pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х.
  • Непроверенная информация pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.
  • TS

    Transfer solution, Буфер для переноса /для NC (хранить при NT):

    Конц.Сток1 l
    Tris-base47.9mM121.1g/M5.8g
    Glycine38.6mM75.05g/M2.9g
    SDS (10%)0.0385%10%3.85ml
    Метанол20%100%200ml
    H2O mQ  
  • Для PVDF: нужно исключить SDS и уменьшить содержание метанола до 100ml/L, остальное так же.
  • PSS

    10х Ponceau S staining solution (хранить при NT, разводить перед применением):

    Конц.Сток5ml100ml
    Ponceau S2%тв.0.1g2g
    trichloroacetic acid30%тв.1.5g30g
    sulfosalicylic acid30%тв.1.5g30g
    H2O mQ   

    WB

    Washing buffer, Раствор для отмывки (готовить перед использованием):

    Конц.Сток100ml
    сухое молоко5%тв.5g
    PBS10х10ml
    Tween-200.1%10%1.0ml
    H2O mQ  

    HB

    Hybridization buffer, Раствор для гибридизации и забивки неспецифической сорбции:

    Конц.Сток100ml
    сухое молоко5%тв.5g
    PBS10х10ml
    H2O mQ  
  • Хранение раствора после гибридизации:
  • если а/т сильные, раствор можно использовать еще несколько раз. Для этого после гибридизации собрать раствор и хранить при -20oC (>месяца).

    SB

    Stripping buffer, Буфер для отшпаривания (готовить перед использованием):

    Конц.Сток10ml
    Tris Cl pH6.850mM1M0.5ml
    SDS2%10%2.0ml
    b-MeEtOH100mM14.5M69 µl
    H2O mQ7.43ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Все способы постановки Western состоят из следующих этапов:
  • 1) перенос белка из геля на мембрану;
    2) забивка неспецифической сорбции;
    3) адсорбция I-антител;
    4) отмывка;
    5) адсорбция II -антител;
    6) отмывка;
    7) проявление фильтра;

  • Какой тип мембраны использовать: NC или PVDV (говорят, последняя чувствительнее) зависит только от вашего вкуса. NC мембрана более хрупкая, но при аккуратной работе это незаметно.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Обрезать ли гель, оставив лишь область, которую вы хотите увидеть на картинке до переноса, после переноса или вообще не обрезать, зависит от вашего желания экономить мембрану и антитела.
  • п.4.

  • Можно в ванночке с гелем.
  • п. 6.

  • Но лучше всё накладывать сразу без пузырей.
  • п. 7.

  • Или ~3mA на индивидуальную полоску.
  • п. 8.

  • Иногда полезно отметить положение границ геля, лунок и т.п.
  • п. 11.

  • Можно проконтролировать как много белка осталось в геле после переноса покрасив гель.
  • Гибридизация.

  • Фильтр всегда должен быть влажным.
  • Высохшую PVDF мембрану нужно смачивать метанолом.
  • Соприкасаться с раствором должна сторонаP(на которую шел перенос).
  • Гибридизация с а/т проводится в гибридайзере при 26oC в маленьких цилиндрах или 50ml ЦФ-пробирках. Объём гибридизационного раствора ~3ml (по возможности минимальный, но чтобы мембрана не подсыхала).
  • Отмывка и забивка: при NT покачивая в ванночке (крышке от типов) V=30-50ml.
  • п. 16.

  • Раствор либо выбросить, либо в нем же проводить гибридизацию, только не надо капать на фильтр концентрированные а/т.
  • Для забивки неспецифики лучше всего использовать сухое молоко, (можно и BSA, но он нам нравится меньше). Разные партии несколько отличаются между собой по интенсивности фона.
  • п. 17.

  • Налить гибридизационный раствор в 50ml ЦФ-пробирку, добавить нужное количество а/т, смешать. Проложить фильтр по стенке пробирки, поставить в гибридайзер.
  • Если вы не знаете в каком разведении работают а/т, то вам придётся определить это экспериментально.
  • Время взаимодействия с антителами можно увеличивать или уменьшать в зависимости от ваших антител.
  • Гибридизация проводится в 0.1-0.15М NaCl, снижение ионной силы вызывает сильную неспецифическую гибридизацию.
  • п. 18.

  • Очень важно!!! Раствором с антителами можно пользоваться несколько раз (5-7). Достаточно заморозить его после использования на -20oС. Эта процедура работает по крайней мере для гибридизационного буфера: 1x PBS(without Mg++/Ca++), 0.3-1.0% Dry milk, Antibodies.
  • п. 20.

  • При иммуноокрашивании после иммунопреципитации фон можно убрать преконъюгировав предварительно вторичные антитела с первичными .
  • Приведённая процедура - не единственная. Варианты:
    1. Все делать при NT на качающейся платформе, гибридизация и забивка в целлофановых пакетах (Vраствора ~1.5мl, в зависимости от размера фильтра), отмывка в ванночке:
      1. забивка: 3% сухое молоко, 1х PBS, 30-40';
      2. "I"а/т: 1h 0.3% сухое молоко, 1х PBS, антисыворотка;
      3. отмывка 3 раза х 5': 1х PBS, 0.05% Tween-20;
      4. "II"а/т: 30' в 1х PBS;
      5. отмывка как в п.3.

      Несмотря на существенно более низкое содержание сухого молока в гибридизационном буфере для "I"а/т и полное его отсутствие в буфере для "II"а/т этот метод давал чистые картинки. Видимо, успех определялся качеством использованных а/т.

    2. Отмывка и забивка проводятся в ванночке. Гибридизация: на стол положить кусок парафильма (больше мембраны), на него - 0.5-1ml гибридизационного раствора с а/т. Положить мембрану стороной (Р) к раствору, избегая пузырей, сверху прикрыть куском парафильма размером с мембрану. Инкубировать 1h.
    3. Этот способ сокращает объём гибридизационной смеси, но может ухудшить качество гибридизации.

    п. 27.

  • Максимум свечения наступает через 4-5' после нанесения раствора (разумная интенсивность свечения сохраняется в течение 15-20').


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100