Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Определение концентрации белка.

Bicinchoninic acid protein assay kit.


  1. приготовить "Protein determination mix":
  2. Количество реакций1x
    CuSO4(II), 4%4µl
    Bicinchonic acid200µl
  3. составить контрольные смеси "a"-"e":
  4.   H2O Protein determination mix Protein standart (0.2µg/µl) Количество белка (µg)
    а 10µl 200µl - 0 µg
    b 9µl 200µl 1µl 0.2µg
    c 8µl 200µl 2µl 0.4µg
    d 6µl 200µl 4µl 0.8µg
    e - 200µl 10µl 2.0µg
  5. составить экспериментальные смеси, лучше - несколько разведений:
  6. 200µl (Protein determination mix) + (образец в V=10µl);

  7. инкубировать
  8. * по методике кита 37oC, 30' (можно NT, ON),
    * по "Guide to protein purification" 60oC, 30'. Написано, что это повышает чувствительность и уменьшает белок-белковые различия;

  9. охладить до NT;
  10. измерять OD562(от низких концентраций к высоким, тогда не придется мыть ячейку);
  11. по значениям "a"-"e" построить калибровочную таблицу, рассчитать концентрации в экспериментальных образцах.


    Комментарии.

    Общие.

    Допустимые для BCA prot. assay концентрации примесей (на 10µl).

    Кислоты и основания
    HCl0.1M
    NaOH0.1M
    PCA<1%
    TCA<1%
    Буфера
    Acetate0.2M
    (NH4)2SO420%
    Borate10mM
    Citrate<1mM
    Glycine1M
    HEPES100µM
    Phosphate250mM
    Tris0.1M
    Детергенты
    Brij 351%
    CHAPS1%
    Lubrol PX1%
    Octyl-glucoside1%
    SDS1%
    TritonX-1001%
    Tween-201%
    Восстановители
    DTT<1mM
    bMeEtOH<1%
    Miscellaneous
    DNA/RNA20µg
    DMSO5%
    EDTA10mM
    Glycerol10%
    KCl<10mM
    NaCl1M
    Sucrose40%
    Urea3M
  • Непроверенная информация Кит можно использовать для определения не только белковой, но и солевой фракции, сходящей с колонки. Для этого образец вносят на колонку с 1mM ascorbat Na (который идёт вместе с солью). В этом случае asсorbate "проявляется" сразу же после добавления "Protein determination mix", а белки - только после прогрева.
  • По пунктам.

    п. 4.

  • При желании время "проявления" можно значительно сократить: пробирки поместить в водяную ванночку и обработать ~20'' в микроволновой печина полной мощности.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100