Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Окрашивание белка на 3MM.

Определение концентрации белка на 3ММ.

Наиболее удобный метод, когда речь идет об оценке концентрации белка в большом количестве образцов (например, фракции с колонки).

    Нанесение образцов на 3MM
  1. на 3MM бумагу нанести ряд 2х разведений BSA (по ~1µl);
  2. нанести образец:
  3. качественная оценка в ряде образцов:

    нанести ряд образцов (по ~1µl);

    количественное измерение:

    нанести 2х разведения измеряемого белка (по 1µl);

  4. cушить (либо "Ветерок" ~5', либо 65oС ~10');
  5. смочить в ацетоне, высушить;
  6. красить ~5' в Staining Solution;
  7. отмывать в Dest. solution (~5-15');
  8. степень отмывки контролировать визуально;
  9. сполоснуть водой;
  10. высушить, вклеить в журнал.

    Растворы.

    Staining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):

    Конц.Сток100ml
    Coomassie Blue R2500.25тв.0.25g
    Метанол45%100%45ml
    H2O45%mQ45ml
    Уксусная к-та10%ледяная10ml
  • Растворять краситель на бактериальном шейкере, затем фильтровать через бумажный фильтр.
  • Destaining solution

    (хранить при NT в плотно закрытой посуде):
    двухфазна система, состоящая на 10-20% из бутанола и на 90-80% из:

    Конц.Сток100ml
    Уксусная к-та5%ледяная5ml
    H2O95%mQ95ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Наиболее удобный метод, когда речь идет об оценке концентрации белка в большом количестве образцов (например, фракции с колонки).
  • Основной недостаток метода - низкая точность.
  • Достоинства - быстро, просто, дёшево, позволяет анализировать одновременно десятки образцов. Очень слабо чувствителен к раствору, в котором находится белок. => Этот метод - альтернатива точных методов, когда речь идет об измерении концентрации белка, растворенного в неудобном буфере.
  • Дополнительно, смотри замечания к "Окрашивание белковых гелей Coomassie brilliant blue R250."

    По пунктам.

    п. 1.

  • Растворы белков часто набираются в тип более или менее точно только в первый раз. Потом - какие-то фокусы с поверхностным натяжением приводят к тому, что в тип затягивается большее количество раствора. => надо обязательно контролировать объем визуально.
  • Контрольная полоса совершенно необходима в случае количественных измерений. Лучше, когда она присутствует и в качественных.
  • п. 2

  • Разведения обязательны, т.к. при одиночном нанесении ошибка может быть очень высока, особенно, если угодить в диапазон слишком высоких (насыщающих) концентраций.
  • п. 3, 4.

  • Фиксация белка на бумаге.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100