Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > Окрашивание гелей серебром.

Серебряное окрашивание белковых SDS-PAA гелей (аммонийный метод).

Наиболее чувствительный метод окрашивания белковых гелей. Но и наиболее трудоёмкий.

    Фиксация.

  1. фиксировать в 20% ТХУ, >1h (больше для высокопроцентных гелей; ещё лучше ON);
  2. 2x20' "Stop";
  3. 2x20' H2O.
  4. Сенситизация.

  5. 30' в 10% глутаральдегиде;
  6. 3x20' H2O.
  7. Окрашивание.

  8. 30' SD;
  9. 3x5' H2O.
  10. Проявление.

  11. 5-10' в проявителе;
  12. остановить 3-5' в "Stop";
  13. перед хранением или сушкой сполоснуть в H2O.

    Растворы.

    ТХУ

    20% (хранить при NT):

    Конц.Сток30ml

    ТХУ

    20%100%6ml

    H2O

     mQ24ml

    10% раствор глутаральдегида

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток10ml15ml

    Glutaraldehyde

    10%25%4ml6ml

    H2O

     mQ6ml9ml

    SD

    Silver diamine solution (должен быть свежим):

    Конц.Сток15ml

    NaOH

    19mM0.1M2.84ml

    NH4

    0.49% (w/v)35% (w/v)0.21ml

    AgNO3

    0.8% (w/v)20% (w/v)0.6ml

    H2O

     mQ11.04ml

    Проявитель

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml

    Citric acid

    0.005% (w/v)1% (w/v)0.5ml

    Formaldehyde

    0.019% (w/v)36% (w/v)52µl

    H2O

      99.45ml

    Stop

    (хранить при NT):

    Конц.Сток500ml

    EtOH

    40%96%208ml

    Уксусн. к-та

    10%100%50ml

    H2O

     mQ242ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Чувствительность ~0.1-1.0ng белка на бэнд.
  • Метод весьма чувствителен, поэтому необходимо:
  • * работать только в перчатках;
    * качество воды очень критично, на всех этапах использовать только mQ.

  • нельзя использовать b-MeEtOH в качестве агента, восстанавливающего дисульфидные связи: он вызывает появление двух артефактных полос в районе 50 и 67kDa.
  • серебряное окрашивание мешает экспозиции3H - изотопов.
  • сообщалось о возможности повысить чувствительность метода в 2-9/40-50 раз с помощью двойного окрашивания: предварительное окрашивание Coomassie Blue (нормальная/колоидная форма), а затем - серебряное окрашивание.
  • Вещества, влияющие на окрашивание:
  • SDS
    Глицин
    Tris
    Мочевина
    Глицерин
    Уксусная кислота
    Белки - вызывают сильное фоновое окрашивание

    По пунктам.

    п. 6.

  • К NH4(35%) добавить 0.1M NaOH, затем, перемешивая, понемногу добавлять AgNO3. Когда выпадет коричневый осадок, растворить добавлением минимального количества NH4. Довести объем до 100 ml H2O. Раствор нестабилен, должен быть использован в течение 5'. окрашивание проводится только в перчатках.
  • п. 8.

  • После 10' существенно возрастает фон.
  • Проявление продолжается ещё 2-4' после удаления геля из проявителя.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100