Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с белками > SDS PAAG.

Электрофорез белков.


    Выбор % разрешающего геля.

    Размер белка, kDa%AA
    36-2055%
    24-2057.5%
    14-20510%
    14-6612.5%
    10-4515%

    Подготовка форезного аппарата.

  1. вымыть камеры детергентом, хорошо сполоснуть;
  2. мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком); если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол - силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов);
  3. Дегазирование геля
  4. оценить объем геля:
  5. гель: камера:
    минимиди
    концентр.~2ml~4ml
    разреш.~10ml~15ml
  6. приготовить нижний/разрешающий гель (без TEMED);
  7. Заливка геля
  8. дегазировать ~10', во время дегазации заняться форезным прибором:
  9. * собрать форезный прибор, отметить фломастером уровень концентрирующего геля (длина зубчиков гребенки + 1сm);
    * ~5-10ml расплавленной 1.5% агарозы (в GTB-буфере) налить на ровную горизонтальную поверхность. Сразу же установить прибор со стеклами (агароза поднимется между стеклами на ~2-10mm).
    * "пролить" агарозой внешние края спейсеров;

  10. залить концентрирующий гель до отметки;
  11. наслоить сверху бутанол (~3-10mm);
  12. во время полимеризации дегазировать концентрирующий гель;
  13. после завершения полимеризации отсосать бутанол, 2-3 раза сполоснуть получившийся карман дистиллированной водой, отсосать остатки вытянутым типом;
  14. вставить (не полностью) гребенку между стеклами;
  15. залить концентрирующий гель, вставить полностью гребёнку;
  16. после полимеризации установить верхнюю камеру в нижнюю, залить буфер, вытащить гребенку;
  17. немедленно промыть лунки шприцом, поправить изогнувшиеся перегородки между карманами (либо плоским типом, либо иглой шприца);
  18. Форез.

  19. материал + буфер для нанесения, смешать, перед форезом прокипятить 5';
  20. перед нанесением промыть лунки шприцом;
  21. гнать при напряжении (для мини- и миди-камеры) ~10V/cm в концентрирующем геле, ~180V в разрешающем.

    Растворы.

    TGB

    Tris-Glycine buffer 5x, pH8.3, (хранить основной сток при+4oС, рабочий сток - приNT).

    1x5xСток1L1.5L
    Tris-base25mM125mM121.1g/M15.1g22.71g
    Glycine250mM1.25M75.05g/M94g141g
    SDS0.1%0.5%10%50ml75ml
    H2O  mQ   

    Разрешающий гель

    (готовить непосредственно перед применением)  

    10ml
    5%6%7.5%10%12.5%15%
    AA, 30%1.666ml
    2.0ml
    2.5ml
    3.33ml
    4.16ml
    5.0ml
    H2O, mQ4.384ml
    4.05ml
    3.55ml
    2.72ml
    1.89ml
    1.05ml

     Конц.Сток10ml  
    Tris-Cl pH 8.8375mM1M3.75ml  
    SDS0.1%10%0.1ml  
    PSA0.1%10%0.1ml  
    TEMED0.08%100%8µl  

    Концентрирующий гель

    (готовить непосредственно перед применением):

    Конц.Сток1ml2ml3ml4ml5ml
    H2O mQ0.68ml1.4ml2.1ml2.7ml3.4ml
    AA5%30%0.17ml0.33ml0.5ml0.67ml0.83ml
    TrisxCl pH6.80.13M1M0.13ml0.25ml0.38ml0.5ml0.63ml
    SDS0.1%10%10µl20µl30µl40µl50µl
    PSA0.1%10%10µl20µl30µl40µl50µl
    TEMED1µl/ml 1µl2µl3µ14µl5µl

    30% AA

    (стоковый раствор: АА:BIS=29:1(хранить при+4oС, можно несколько месяцев).

    Конц.Сток100ml150ml200ml
    AA29% (w/v)тв.29g43.5g58.0g
    BIS1% (w/v)тв.1g1.5g2.0g
    H2O mQ    

    2x SDS- gel loading buffer

    (готовить без DTT, хранить при NT; DTT добавлять в аликвоту, которую хранить при +4oС и использовать в течении месяца):

    Конц.Сток10ml
    Tris-HCl (pH 6.8)50mM1M0.5ml
    Dithiothreitol100mM1M1.0ml
    SDS2%10%2.0ml
    Bromphenol blue*0.1%~100х0.1ml
    Glycerol10%100%1.0ml
    1.25g

    H2O mQ5.4ml
  • можно готовить и 4х;
  • 4x SDS- gel loading buffer with b-MeEtOH

    Нельзя использовать при серебряном окрашивании.
    (Готовить без b-MeEtOH, хранить при NT; b-MeEtOHд обавлять в аликвоту, которую хранить при +4oС и использовать в течении месяца)

    Конц.Сток10ml
    Tris-HCl (pH 6.8)200mM1M2.0ml
    b-MeEtOH400mM14.5M280 µl
    SDS4%10%4.0ml
    Bromphenol blue*~0.01%~100х0.1ml
    Glycerol40%100%4.0ml
    5.0g

    H2O mQno 
  • мы добавляем совсем немного бромфенолового синего. Он нужен лишь для того, чтобы: (i) видеть образец в лунке, (ii) видеть положение фронта фореза. Количества, которые обычно приводятся в методиках дают слишком жирную полосу, которая даже мешает окрашиванию.


    Комментарии.

    Общие.

  • Разрешающий и концентрирующий гели имеют различные буфера, поэтому залитый гель нельзя долго хранить. В крайнем случае его можно оставить ON на +4oС, не вынимая гребёнку и замотав верх и низ SaranWrap, чтобы не подсыхал.
  • Бромфеноловый синий идёт с фронтом фореза. Ниже него белков нет.
  • Опасно наносить на форез белок в высокой концентрации соли: 1) K+ (и некоторые другие катионы) способны выпадать в осадок с белком и SDS, 2) высокая соль не позволяет белкам войти в гель. Однако, часто концентрирующий гель способен обеспечить хорошую картинку даже если вначале в ячейке выпал осадок.
  • В случае бактериальной культуры средней плотности на одну лунку PAAG 0.75х2.5mm2 нужно брать материал из ~15 µl бактериальной культуры.
  • По пунктам.

    п. 0.

  • Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
  • п.5.

  • Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить раза в полтора количество PSA и TEMED).
  • п.6.

  • Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
  • п. 9.

  • Можно промакнуть сложенной фильтровалкой.
  • п. 10.

  • Вставлять гребенку после заливки геля - ненужная суета во время полимеризации, кроме того она выдавит в камеру значительный объём геля.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100