Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Библиотеки > Анализ клонов после первичного скрининга.

PCR-гибридизация первичного скрининга cDNA библиотеки.

PCR-гибридизация после первичного скрининга позволяет:
а) отличить истинно-позитивные сигналы от ложно-позитивных,
б) оценить размер вставки индивидуальных клонов.

  1. выколоть зоны локализации сигналов;
  2. перенести их в 1.7ml микроцентрифужные пробирки, с SM/хлороформ = 500 µl/20 µl;
  3. элюция фага 2h на качалке 37oС или в холодильнике ON (суспензию фага хранить при 4oС);
  4. PCR амплификация в объёме 15 µl:
  5. суспензию фага из п.3 ЦФ 5' NT;
  6. в каждую PCR-пробирку добавить по 1 µl суспензии фага;
  7. параметры PCR:
  8. I. Td = 95oC, => 1';
    II. 28 циклов:

    Td = 94oC, => 10'';
    Ta = 48.5oC, => 25''
    Te = 68oC, => 3-6';

    III. T = 4oC;

  9. нанести PCR-реакции на 1% агарозный гель;
  10. Саузерн-блот;
  11. гибридизация.

    Растворы.

    Стоковый PCR-mix.

    Конц.Сток100µl
    Буфер 10х10µl
    MgCl22.5mM25mM10µl
    dNTP’s 200µM10mM2µl
    Primer T3&T70.1µM10µM1+1µl
    Taq/Pfu pol mix0.05u/µl5u/µl1µl
    Буфер для внесения20µl
    H2O mQ55µl


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 4

  • Использованные нами праймеры:
  • #T320bATTAACCCTCACTAAAGGGA
    #T720bTAATACGACTCACTATAGGG

    п. 6

  • Хлороформ не оказывает никакого влияния на PCR-реакцию.
  • 5х буфер для внесения позволяет сразу же вносить PCR реакции в лунки геля.
  • Состав буферов, относящихся к PCR смотри в "Состав PCR реакции".
  • п. 7

  • Время на этапе элонгации зависит от ожидаемой длины cDNA.
  • п. 10

  • Для гибридизации можно использовать тот же буфер, который уже был применён для первичного скрининга (предгибридизация в новом буфере, затем его слить и залить старый гибридизационный буфер, предварительно прогретый 3' в кипящей бане).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100