Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Библиотеки > Скрининг фаговой библиотеки.

Скрининг фаговой библиотеки.


    Высев фаговой библиотеки.

  1. клетки (обычно LE 392) вырастить в ТВ/Mg/мальтоза 30oC, ON;
  2. чашки с нижним LTB/Mg агаром поставить на 37oС на 1h;
  3. верхний LTB/Mg агар (из расчёта по 3.5ml на чашку d=8cm) расплавить, охладить до 47oС (держать в водяной бане 47oС);
  4. приготовить общую смесь фаг лямбда+клетки (из расчёта на отдельную d=8cm чашку ~40µl клеток и не более 12 000pfu фага лямбда);
  5. 37oС, 20' не качая;
  6. смесь фаг лямбда+клетки (п.5) перенести в верхний агар (п.3), смешать;
  7. быстро разлить пипеткой по 3.5 ml на чашку.
  8. Снятие реплик.

  9. чашки охладить 4oС (1h);
  10. мембраны подписать карандашом;
  11. накладывать мембраны надписью вверх так, чтобы номер на мембране находился над надписью на чашке;
  12. оставить на 5';
  13. Проколы мембраны на чашке
  14. иглу прокалить, ~5 раз проткнуть мембрану и агар равномерно по площади (но не по периметру) чашки. Следить, чтобы проколы были вертикальными и не попадали на надпись на чашке;
  15. снять фильтр, зацепив пинцетом с той стороны, которая находится ближе всего к бортику чашки;
  16. если требуется, аналогичным образом (п.1-6) снять вторую (третью, четвертую) реплики, каждую следующую держать на чашке на ~3' дольше, чем предыдущую;
  17. денатурация ~5' (не более 10'!!!);
  18. промакнуть на фильтровалке;
  19. нейтрализация >=5';
  20. промакнуть на фильтровалке;
  21. прижечь UV;
  22. 5-10' полоскать в 4хSSC. Если пристали кусочки агара, снять их в 4хSSC стеклянным шпателем, обернутым марлей;
  23. высушить фильтры, хранить при NT, чашки хранить ~2 месяца на +4oС.
  24. Гибридизация.

  25. можно проводить как в гибридайзере, так и в чашке Петри, помещённой в качающуюся баню (накрыть перевернутой крышкой, сверху – грузик; гибридизационного буфера должно быть достаточно много, чтобы мембраны не слипались). После гибридизации гибридизационный буфер не выбрасывать – он пригодится для проведения вторичного скрининга.
  26. Отмывка.

  27. (I) 3-4х 10', NT-68oC:
  28. Конц.Сток1L
    SSC1x20x50ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ940ml
  29. (II) 2х 20-25', 68oC:
  30. Конц.Сток1L
    SSC0.2x20x10ml
    SDS0.1%10%10ml
    H2O mQ980ml

    Вторичный скрининг.

  31. выколоть бляшку в 800µl SM + 2 капли хлороформа, вортекс;
  32. либо интенсивно качать 37oС 2h, либо 4oС без качания ON;
  33. ЦФ, развести 2µl суспензии фага в 1ml SM;
  34. определение титра в капельках агара
  35. контрольный высев:
    1. 1µl разведённого фага (из п.27) + 5µl культуры клеток,
    2. 37oC, 20',
    3. + 100µl верхнего LB/Mg агара, смешать, нанести на чашку с нижним LB/Mg агаром,
    4. бляшки появляются через 6-8 часов;
  36. рассчитать титр фага и провести препаративный высев (~100-200 бляшек на чашку).

    Растворы.

    Денатурирующий буфер

    (хранить при NT).

    Конц.Сток100ml150ml300ml500ml750ml
    NaCl1.5M58.44g/M8.766g13.15g26.30g43.83g65.75g
    NaOH0.5M10M 5ml
    6.65g
    7.5ml
    9.97g
    15ml
    19.94g
    25ml
    33.23g
    37.5ml
    49.84g

      40g/M2g3g6g10g15g

    Нейтрализующий буфер

    (хранить при NT).

    Конц.Сток150ml300ml500ml750ml
    Tris Cl, pH7.41M121.1g/M18.15g36.3g60.5g90.75g
    NaCl1.5M58.44g/M13.15g26.30g43.83g65.75g
    HCl~0.81M11.6M/L~10.5ml~21ml~35ml~52.5ml
    EDTA (optional)1mM0.5M0.3ml0.6ml1ml1.5ml


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Или 37oC - не долго, чтобы не доводить до насыщения.
  • Для первичного высева лучше использовать, если это возможно, клетки, обеспечивающие селекцию против вектора без вставки.
  • п. 2.

  • Чашки прогреваются для того, чтобы не было проблем, связанных с преждевременным застыванием верхнего агара.
  • Для чашек используется LТВ агар, т.к. использование бедной среды уменьшает размер бляшек.
  • Очень важно заливать чашки и разливать верхний агар на строго горизонтальной поверхности, иначе плотность высева будет очень неравномерной. или, если уж приходится делать это на не выровненной поверхности, то чашки должны находиться в одном и том же положении - для контроля надо сделать отметки на бортиках.
  • п. 3.

  • Однажды у нас была банка с бакто-агаром, который начинал застывать при 47oС. Выход из этой ситуации - сменить агар, а тот, который застывает, использовать для приготовления нижнего агара.
  • п. 5.

  • Адсорбция фага лямбда на клетки, проникновение внутрь. Превышение времени инкубации чревато тем, что какой-нибудь фаг лизирует клетку и успеет размножиться. В некоторых методиках для синхронизации заражения, клетки с фагом держат без встряхивания при 0oC 25' - адсорбция, а затем при 37oC 5' - проникновение.
  • п. 8.

  • Чтобы агар стал более твердым и мембрана не прилипла. Попытка заменить {1h при 4oС} на {5' при -20oC} приведёт к тому, что поверхность агара станет мокрой.
  • п. 10.

  • На самом деле важно только, чтобы мембраны расположились на чашках одинаковым образом (это существенно упрощает последующий анализ автографов). Накладывать мембрану выгнув, последовательно от центра к краям.
  • п. 12.

  • Проколы делаются для того, чтобы потом сориентировать сигнал на автографе относительно чашки. Т.к. мембрана после гибридизации слегка меняет размер, для такой ориентации особое значение имеют проколы ближайшие к сигналу. Нанесение проколов равномерно по площади гарантирует, что для любой точки чашки ближайшие проколы окажутся не слишком далеко.
  • "Вертикальность проколов". Мембрана ложится на агар, а автограф будет приложен ко дну чашки. Чтобы соответствие было аккуратным, проколы должны быть вертикальными.
  • п. 13.

  • Если поступить наоборот и брать пинцетом сторону, которая дальше всего отстоит от бортика чашки, то мембрана зацепится за бортики своими краями и "скользнёт" по поверхности агара (это может привести к разрушению слоя верхнего агара).
  • п.25-29.

  • На вторичный скрининг лучше использовать нитроцеллюлозные мембраны - они дешевле. При этом так же можно пользоваться UV-пришивкой (хотя во многих руководствах утверждается, что нельзя).
  • Мы используем для вторичного скрининга тот же гибридизационный буфер с меткой, что был использован для первичного (предгибридизационный буфер – свежий, а "старый" гибридизационный надо перед внесением прогреть ~3' в кипящей бане; его можно даже сохранить для картирования фагов).
  • п. 28.

  • Контрольный высев (1/2x105 часть бляшки) проводиться только для определения титра фага. Если используются чашки с нижним агаром диаметром 150mm, то на одной чашке умещается ~40 "капель-титров" верхнего агара.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100