Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > РНК > Синтез in vitro.

Синтез RNA in vitro.

Метод для синтеза RNA in vitro прямо на неочищенной PCR смеси.
Владимир Антоненко. Пущино, Институт Белка РАН, группа генной инженерии.

  1. составить смесь:
  2. Конц.Сток100µl
    DNA (неочищенный PCR-продукт)10-20µg/ml0.1-0.2µg/µl10µl
    Transcription buffer1x5x20µl
    NTP mix1x5x20µl
    Inorganic pyrophosphatase*10u/ml???1u
    BSA0.1mg/ml10mg/ml1µl
    Спермидин2mM100mМ2µl
    RNasin (RNAguardTM, Boehringer)500u/ml???50u
    T7 RNA полимераза5u/µl???500u
    H2O mQ  
  3. инкубировать 37oC, 2h;
  4. объем реакционной смеси довести до 200µl mQ, экстрагировать 1/2V кислого фенола, встряхивать 1-2', ЦФ >4krpm, NT, 5';
  5. экстрагировать 1/2V фенол/хлороформ (1:1), ЦФ >4krpm, NT, 5';
  6. добавить 125µl 8M LiCl (т. е. довести до 3М), 30' на льду, ЦФ 14krpm, NT, 5';
  7. осадок растворить в 140µl mQ, добавить
  8. 70µl 7.5М AcNH4 (1/2V),
    3V этанола;

  9. инкубировать при -70oC, 1h, ЦФ 14krpm, NT, 10';
  10. осадок промыть 2 раза 80%, 1 раз 95% этанолом, растворить в mQ;
  11. хранить при -70oC, желательно по аликвотам.

    Растворы.

    5x Transcription buffer

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток10ml50ml
    Hepes-KOH, pH 7.6600mM1M6.0ml30.0ml
    MgCl2100mM1M1.0ml5.0ml
    DTT100mM1M1.0ml5.0ml
    H2O mQ2.0ml10.0ml

    5x NTP mix

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток100µl2.0ml
    ATP20mM100mM20µl0.4ml
    GTP20mM100mM20µl0.4ml
    CTP20mM100mM20µl0.4ml
    UTP20mM100mM20µl0.4ml
    H2O mQ20µl0.4ml


    Комментарии.

    Общие.

  • С помощью данной методики получали транскрипты с PCR-фрагментов для трансляции в бесклеточных системах, где необходимы большие количества RNA. В моей практике из 100µl реакционной смеси получается примерно 200-300µg RNA.
  • Т7 промотор становится более активным если на его 5'-конце есть 3-4 дополнительных нуклеотида, и если после промотора есть 1-2 "G".
  • По пунктам.

    п. 1.

  • * Пирофосфатаза хотя и увеличивает выход RNA, но незначительно, а по количеству выпавшего пирофосфата можно судить о интенсивности транскрипции. Избавиться от него легко центрифугированием 8krpm, 1'.
  • п. 2.

  • Активность T7 полимеразы максимальна при 42oC. Хотя и считается, что при повышенных температурах выход укороченных продуктов увеличивается, иногда в целях увеличения выхода RNA, реакцию целесообразнее проводить именно при 42oC.
  • п. 3.

  • DNA уходит из водной фазы.
  • п. 5.

  • Избирательное осаждение RNA.
  • п. 8.

  • Отмывку лучше проводить этанолом комнатной температуры - происходит лучшее освобождение от солей.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100