Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > РНК > Выделение из мух (Протеиназа К).

Выделение RNA из мух (с Протеиназой К).

Метод для выделения РНК прочно связанной с белками.
     Подготовила Оксана Кравчук, Институт Биологии гена.

  1. гомогенизировать 100 мух в 2ml DB;
  2. инкубировать 37oС, 20';
  3. очистка фенол-хлороформ, хлороформ;
  4. добавить
  5. 50µl 8 М LiCl,
    3V EtOH; осадить;

  6. растворить осадок в 200µl H2O и осадить равным объемом 4M LiCl при 4oС в течении ночи;
  7. растворить осадок в 200µl H2O и добавить 3 объема этанола (так хранить);
  8. если нужно осадить, то добавить 20µl 3М AcNa, pH 5.1

    Растворы.

    DB (digestion buffer)

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml100ml
    NaCl100mM1M5.0ml10.0ml
    TrisCl, pH 7.050mM1M2.5ml5.0ml
    EDTA20mM0.5M2.0ml4.0ml
    SDS1%10%5.0ml10.0ml
    Proteinase K*50µg/ml20µg/µl125µl250µl
    H2O mQ35.5ml71ml

    * Proteinase K добавляется непосредственно перед применением.



    Комментарии.

    Общие.

  • Преимущество метода в том, что на начальных стадиях выделения не используется фенол, и поэтому не теряется РНК, прочно связанная с белком.
  • Протокол взят из статьи: Danilevskaya ON, Traverse KL, Hogan NC, DeBaryshe PG, Pardue ML. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol Cell Biol. 1999 19(1):873-81.
  • По пунктам.

    п. 3.

  • Также, как для ДНК. Можно использовать как нейтральный, так и кислый фенол.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100