Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > РНК > Выделение из мух (CsCl).

Выделение RNA из мух центрифугированием через CsCl.


  1. к ~0.8g мух, растёртых в жидком азоте добавить 3.5ml GTC;
  2. залить жидким азотом, растереть в порошок;
  3. смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19G иглу;
  4. добавить Sarcosile до 0.5% (175µl 10%), смешать;
  5. ЦФ >5krpm, NT, 10';
  6. супернатант наслоить на 9.7ml CsCl/EDTA в ультрацентрифужной пробирке;
  7. ЦФ 32krpm, NT, 24h (SW41);
  8. срезать дно пробирки, сполоснуть 70%EtOH, подсушить NT;
  9. растворить в 150µl:
  10. TE (pH7.6), SDS 0.1%;

  11. дополнительно сполоснуть дно 125µl, объединить;
  12. Ф:Х, Х;
  13. добавить
  14. AcNa, 3M pH 5.2 1/10V => 30µl,
    EtOH 2.5V => 750µl; осадить;

  15. сполоснуть осадок 70% EtOH;
  16. растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.
  17. Вариант дляTLS-55.

  18. к ~0.1g мух, растёртых в жидком азоте добавить 0.5ml GTC;
  19. залить жидким азотом, растереть в порошок;
  20. смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19G иглу;
  21. добавить Sarcosile до 0.5% (25µl 10%), смешать;
  22. ЦФ NT, 10';
  23. супернатант наслоить на 1.7ml CsCl/EDTA в ультрацентрифужной пробирке;
  24. ЦФ 42krpm, NT, >10h (TLS-55);
  25. срезать дно пробирки, сполоснуть 70%EtOH, подсушить NT;
  26. растворить в 100 + 35µl:
  27. TE (pH7.6), SDS 0.1%;

  28. Ф:Х, Х;
  29. добавить

    AcNa, 3M pH 5.2 1/10V => 15µl,
    EtOH 2.5V => 380µl; осадить;

  30. сполоснуть осадок 70% EtOH;
  31. растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.

    Растворы.

    GTC

    guanidine thiocyanate buffer(хранить в 50mlаликвотах при -20oС).

    Конц.Сток50ml100ml150ml
    Guanidine thiocyanate4M118.16g/M25g50g75g
    Tris Cl, pH 7.5100mM1M5.0ml10.0ml15.0ml
    b-MeEtOH*0.144M14.4M50µl1.0ml1.5ml
    H2O mQ26.0ml52.0ml78.0ml

    p=1.124
    *добавлять непосредственно перед использованием.

    Cs/EDTA

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml100ml200ml
    CsCl5.7M168.4g/M48.0g96.0g192.0g
    EDTA10mM0.5M1.0ml2.0ml4.0ml
    DEPC0.1%100%50µl100µl200µl
    H2O mQ35.80ml71.60ml143.19ml

    p=1.699



    Комментарии.

    Общие.

  • Содержание RNA в мухах: самец ~5.3µg, самка ~7.5µg.
  • Выход этого метода ~1.0-1.2µg/муху.
  • Центрифугирование через CsTFA даёт лучший выход ~2.2-2.3µg/муху; "подушка" на поверхности градиента не образуется (Okayama H et al., Methods Enzymol 154, 3, 1987).
  • По пунктам.

    п. 1, 15.

  • Приготовление мелкодисперсной суспензии - мухи:GTC. При оттаивании GTC быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNases.
  • Аккуратно выливайте жидкий азот в ступку (из небольшого пластикового стаканчика), иначе разлетятся и растертые мухи и не растертые.
  • Обязательно работайте под хорошей тягой. Растертые в пыль мухи могут очень быстро сделать Вас аллергиком.
  • п. 7, 22.

  • После осаждения через CsCl на поверхности градиента образуется плотная подушка, её можно удалить иглой или присосавшись обрезанным типчиком.
  • п. 11, 24.

  • Фенол - кислый.
  • п. 14.

  • Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
  • Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
  • Непроверенная информация Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
    1. в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
    2. можно наносить на форез больший объём образца;
    3. RNA можно хранить и при -20oС.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100