Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > РНК > Выделение из мух (фенол).

Выделение RNA из мух (горячий кислый фенольный метод).

Очень удобный метод. Основное преимущество по сравнению с GTC-методом - низкая цена. К сожалению этот метод работает только для мух (причем для всех стадий развития - от эмбрионов до имаго). В случае клеток (тканей) млекопитающих получается низкий выход и RNA оказывается загрязнённой примесями геномной DNA.

  1. взвесить мух;
  2. в керамической ступке заморозить мух в жидком азоте, растереть в тонкий порошок, долить азот;
  3. долить жидкий азот + "кислый фенол" из расчета 7.5ml на 1g мух;
  4. растереть в порошок;
  5. долить жидкий азот + SNE, столько же, сколько фенола;
  6. растереть в порошок;
  7. расплавить, а затем инкубировать 60oС, 10' периодически смешивая;
  8. 0oС, 2-10' (в зависимости от объёма, чтобы успело остыть);
  9. ЦФ ~1krpm, 4oC, 4';
  10. ЦФ 5krpm, 4oС, 10';
  11. экстрагировать Ф:Х (кисл.), Х;
  12. добавить
  13. 1/10V AcNa, pH 5.2 (3M),
    2.5V EtOH; осадить;

  14. сполоснуть осадок 70% EtOH;
  15. растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.

    Растворы.

    SNE

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml200ml
    SDS1%10%5.0ml20.0ml
    NaAc, pH 5.150mM3M833µl3.33ml
    EDTA10mM0.5M1.0ml4.0ml
    H2O mQ43ml173ml

    проверить pH, если надо, довести до pH5.1 разбавленной уксусной кислотой (1:100).



    Комментарии.

    Общие.

  • Содержание RNA в мухах: самец ~5.3µg, самка ~7.5µg.
  • Выход этого метода ~3.6-4.6µg/муху.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Или сосчитать, 1 муха весит ~1mg.
  • п. 2-6.

  • Приготовление мелкодисперсной суспензии - мухи:фенол:буфер. При оттаивании фенол и SDS быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNases.
  • Аккуратно выливайте жидкий азот в ступку (из небольшого пластикового стаканчика), иначе разлетятся и растертые мухи и не растертые.
  • Обязательно работайте под хорошей тягой. Растертые в пыль мухи могут очень быстро сделать Вас аллергиком.
  • п. 7-9.

  • Надо соблюдать осторожность в п.7 и 8, если пробирка стеклянная. Центрифужные пробирки обычно толстостенные - они плохо выдерживают резкую смену температуры.
  • Экстракция фенолом с низким рН приводит к тому, что DNA уходит из водной фазы.
  • п. 9, 10.

  • Центрифугирование проводится в два этапа, т.к. нам не нравится, когда крупные частицы (хитин, нелизировавшие остатки мух) проходят через водный раствор с высокой скоростью (но, возможно, что здесь это не важно, т.к. раствор RNA не вязкий).
  • п. 14.

  • Мы предпочитаем пользоваться не H2ODEPC, а свежей mQ.
  • Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H2OmQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
  • Непроверенная информация Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:
    1. в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
    2. можно наносить на форез больший объём образца;
    3. RNA можно хранить и при -20oС.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100