Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Геномная ДНК > Выделение из растений.

Выделение геномной ДНК из растений.

Георгиева София,
Институт Молекулярной Биологии

  1. ткань растереть в ступке с жидким азотом до светло-зелёной (а не темно-зелёной) пудры;
  2. подготовить прогретую до 65оС пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25ml 2x CTAB на 2 - 5g ткани);
  3. перенести пудру шпателем в пробирку, очень хорошо и быстро перемешать;
  4. инкубировать при 65оС минимум 20' (лучше 1h, но можно и больше: 2 - 3h);
  5. охладить до NT, добавить равный объём Хлороформа:Изоамилового спирта (Ch:I=24:1), перемешивать ~20' NT;
  6. ЦФ 5krpm NT, 10';
  7. снять водную фазу, добавить к ней 0.2V 5xCTAB;
  8. перемешать, инкубировать при 65оС 10';
  9. добавить равный объём Ch:I, перемешивать ~10' NT;
  10. ЦФ 5krpm NT, 10';
  11. если раствор мутный или большая интерфаза - повторить экстракцию Ch:I (пункты 9 и 10);
  12. добавить равный объём буфера для преципитации (можно и 2 - 3 объёма), перемешать и оставить на 1h (или на ночь) при NT;
  13. ЦФ 5 - 8 krpm NT, 20' (если ДНК не выпадает, добавить больше буфера для преципитации, оставить на комнатной температуре на 1h, отцентрифугировать);
  14. растворить осадок в 1 - 2 ml HS-TE (иногда необходим нагрев до 65оС);
  15. добавить 2V EtOH (абс.), 1 - 2h при -20оС или 30' при -70оС;
  16. ЦФ 8 krpm 4оС, 10';
  17. к осадку добавить 200µl дистиллированной H2O и 100µl 7.5M NH4Ac (pH 7.5) 20', 0оС;
  18. ЦФ 13 krpm 4оС, 10';
  19. добавить к супернатанту 2V EtOH (абс.) 20' при -70оС;
  20. ЦФ 13 krpm 4оС, 10';
  21. сполоснуть 80% EtOH;
  22. растворить в TE или H2O;
  23. хранить при -20оС.

    Растворы.

    2xCTAB буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    CTAB2%(w/v)тв.2.0g10.0g
    NaCl1.4M58.44g/M8.18g40.9g
    Tris Cl, pH 8.00.1M1M10ml50ml
    EDTA20mM0.5M4ml20ml
    H2O mQ   
    CTAB = Cetyltrimethylammoniumbromid
    CTAB растворяется плохо (я нагревала для растворения в микроволновой печке), поэтому лучше приготовить раствор заранее).

    5xCTAB буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток50ml100ml
    CTAB5%(w/v)тв.2.5g5.0g
    EDTA350mM0.5M35ml70ml
    H2O mQ   

    Буфер для преципитации

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    CTAB1%(w/v)тв.1.0g5.0g
    Tris Cl, pH 8.050mM1M5ml25ml
    EDTA10mM0.5M2ml10ml
    H2O mQ   

    HS-TE буфер

    (хранить при NT):

    Конц.Сток100ml500ml
    NaCl1M58.44g/M5.84g29.22g
    Tris Cl, pH 8.010mM1M1.0ml5.0ml
    EDTA1mM0.5M0.2ml1.0ml
    H2O mQ   
    CTAB = Cetyltrimethylammoniumbromid


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: S. O. Rogers & A. J. Bendich Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5; 69-76, 1985 (с модификациями).
  • Листья можно хранить при -70оС.
  • Выход: в зависимости от типа ткани: 0.3 - 200ng DNA на 1mg ткани. В наших руках из листьев арабидопсиса получалось 80ng/mg. Наибольший выход из эмбрионов и листьев, наименьший - из органов хранения крахмала.
  • Получается ДНК размером 40 - 70kbp. Годится для рестрикции и PCR.
  • Принцип работы CTAB описан в протоколе "Другие методы осаждения ДНК(РНК) - PEG, Zn, CTAB".
  • Автор методики не является специалистом по работе с растениями, но работала с этой методикой и она понравилась. Поэтому, если у кого-то есть комментарии или какие-то другие способы, было бы приятно о них узнать.
  • По пунктам.

    п. 1 - 3.

  • Видимо, если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку и растирать и его тоже. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок (в этом случае имеет смысл добавлять ~20µg tRNA как носитель).
  • п. 7.

  • Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1хCTAB буфер до исходного объёма.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100