Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Геномная ДНК > Выделение из мух (фенол).

Фенольный метод выделения DNA из мух.


  1. взвесить мух;
  2. в керамической ступке заморозить мух в жидком азоте, растереть в тонкий порошок;
  3. долить в ступку жидкий азот, добавить DB из расчета 1.2ml на 100mg, растереть;
  4. перенести замороженный порошок в пробирку;
  5. 56oС, > 3h;
  6. мягко экстрагировать равным объёмом фенола;
  7. ЦФ в два этапа:
  8. (1) 1.5krpm, NT, 5',
    (2) 4.5krpm, NT, 10';

  9. мягко экстрагировать Ф:Х, Х, (ЦФ 4.5krpm, NT, 10');
  10. Осаждение EtOH.

  11. добавить:
  12. AcNH4 10M 1/4V,
    EtOH (96%) 2V;

  13. комочек DNA прополоскать, перенеся типом в 70% EtOH;
  14. подсушить (не пересушить!), растворить в TE или H2O (из расчёта ~1µl/муху).
  15. Диализ.

  16. поместить DNA в диализный мешок;
  17. диализ: ~сутки против нескольких смен TE.

    Растворы.

    DB

    digestion buffer (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml100ml
    NaCl0.1M5M1.0ml2.0ml
    Tris Cl, pH 8.010mM1M0.5ml1.0ml
    EDTA25mM0.5M2.5ml5.0ml
    SDS0.5%10%2.5ml5.0ml
    Proteinase K*0.1mg/mlтв.
    20mg/ml
    5mg
    250µl
    10mg
    0.5ml

    H2O mQ43.5ml87ml

    * - перед использованием.



    Комментарии.

    Общие.

  • Содержание DNA в мухах: самец ~0.75µg, самка ~1µg.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Или сосчитать, 1 муха весит ~1mg.
  • п. 2, 3.

  • Аккуратно выливайте жидкий азот в ступку (из небольшого пластикового стаканчика), иначе разлетятся и растертые мухи и не растертые.
  • Обязательно работайте под хорошей тягой. Растертые в пыль мухи могут очень быстро сделать вас аллергиком.
  • При растирании мух с DB получается мелкодисперсная суспензия. При оттаивании она превращается в однородный раствор. Prot.K и SDS легко проникают в ядра и лизируют их.
  • п. 5. и далее.

  • См. комментарии к "Выделение геномной ДНК из культуры клеток".

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100