Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Геномная ДНК > Выделение из крови.

Выделение ДНК из крови.


  1. получить кровь из вены добровольца;
  2. добавить 0.5M EDTA до 50mM => 1/10V;
  3. смешать:
  4. препарат крови с EDTA => 1V,
    буфер 1 => 6V;

  5. 0oС, 1-4h;
  6. ЦФ 1.5krpm, 4oС, 15';
  7. удалить супернатант;
  8. осадок ядер суспендировать в "буфер 2" в объеме, равном 0.8V взятого препарата крови;
  9. добавить
  10. proteinase K до 50µg/ml,
    SDS 10% до 1%, => 1/10V;

  11. 37oС, ON;
  12. добавить 3.0M AcONa pH7.5 до 0.3М => 1/10V;
  13. мягко экстрагировать нейтральным Ф, Ф:Х, Х (ЦФ 5krpm, NT, 10');
  14. осадить NaCl/EtOH;
  15. промыть 70% EtOH;
  16. растворить осадок в H2O.

    Растворы.

    буфер 1

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток300ml
    сахароза320mM342.3g/M32.86g
    Triton X-1001%10%30ml
    Tris Cl pH7.65mM1M1.5ml
    MgCl25mM1M1.5ml
    H2O mQ  

    буфер 2

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток80.0ml
    EDTA pH 8.025mM500mM4.0ml
    NaCl75mM5M1.2ml
    H2O mQ74.8ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Содержание DNA в лейкоцитах: 30-60 µg/ml крови.
  • По пунктам.

    п.2.

  • EDTA предотвращает свертывание крови. В некоторых методах для этого используют гепарин, но он является мощным ингибитором PCR и благополучно проходит сквозь всю процедуру очистки.
  • п.3, 4.

  • Triton X-100 лизирует клеточную мембрану, но не разрушает ядро. На этом этапе вскрываются кровяные клетки, от лейкоцитов остаются только ядра.
  • п. 5.

  • Осаждение ядер лейкоцитов.
  • п.7.

  • Получение суспензии ядер.
  • п.9.

  • Расщепление белков Prot.K.
  • После инкубации на 37oС можно прерваться на 1-2 дня (хранить при +4oС).
  • п.10.

  • Соль лучше добавить до фенольной экстракции, т.к. экстракция фенолом в низкосолевом буфере может быть связана со значительными потерями DNA.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100