Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Геномная ДНК > Выделение из культуры клеток.

Выделение геномной ДНК из культуры клеток.


  1. 2х промыть клетки PBS, 0oC;
  2. соскоблить клетки;
  3. ЦФ 1krpm 4oC, 5';
  4. ресуспензировать в Buf. I (из расчета ~4.5ml на чашку d=8cm);
  5. добавить 4.5ml Buf. I/NP40, смешать;
  6. 0oC, 5';
  7. ЦФ 1krpm 4oC, 5';
  8. сбросить супернатант;
  9. ресуспензировать осадок в 10ml Buf. I (сначала вортекс осадка, а потом добавлять понемногу Buf. I и вортексировать);
  10. ЦФ 1krpm 4oC, 5', ресуспензировать в 2ml Buf.I;
  11. быстро смешать с 20ml Buf.II;
  12. 37oС ON, или 56oС, >3h;
  13. мягко экстрагировать Ф;
  14. ЦФ в два этапа:
  15. (1) 1.5krpm, NT, 5',
    (2) 4.5krpm, NT, 10';

  16. мягко экстрагировать Ф:Х, Х, (ЦФ 4.5krpm, NT, 10');
  17. Осаждение EtOH.

  18. добавить:
  19. AcNH410M => 1/4V,
    EtOH 96% => 2V;

  20. комочек DNA прополоскать, перенеся типом в 70% EtOH;
  21. подсушить (не пересушить!), растворить в TE или H2O.
  22. Диализ.

  23. поместить DNA в диализный мешок;
  24. диализ: ~сутки против нескольких смен TE.

    Растворы.

    Buf. I

    (хранить при 4oC)

    Конц.Сток10ml50ml
    Сахароза0.3M342.3g/M1.03g5.13g
    KCl60mM1M0.6ml3.0ml
    NaCl15mM5M30µl0.15ml
    Tris Cl pH8.260mM1M0.6ml3.0ml
    Spermidine0.5mM1M5µl25µl
    Spermine0.15mM1M1.5µl7.5µl
    EDTA2mM0.5M40µl0.2ml
    H2O mQ   
  • Spermidin (free base), 145.2g/M
  • Spermine x3HCl, 348.2g/M
  • отсыпать и взвесить небольшое количество (~30-100mg), рассчитать объём, растворить. Хранить -20oС.

    Buf. I/NP40

    (хранить при 4oC)

    Конц.Сток10ml50ml
    Б.I0.9x1x9.0ml45.0ml
    NP-401%10%1.0ml5.0ml

    Buf. II

    (хранить при NT)

    Конц.Сток10ml50ml
    NaCl0.1M5M0.2ml1.0ml
    Tris Cl pH8.210mM1M0.1ml0.5ml
    EDTA25mM0.5M0.5ml2.5ml
    SDS0.5%10%0.5ml2.5ml
    Proteinase K*300µg/ml20µg/µl150µl750µl
    H2O mQ8.55ml42.75ml

    *перед использованием.



    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Отмывка клеток от ростовой среды.
  • п. 4.

  • Клетки ресуспензируются в изотоническом растворе.
  • п. 5.

  • NP-40 лизирует клеточную оболочку, но не повреждает ядерную.
  • п. 7-10.

  • Удаление цитоплазмы, получение суспензии ядер. Важно хорошо суспензировать ядра, иначе комочки ядер покроются вязкой "шубой" DNA, которая защитит их внутренность от проникновения SDS и ProtK;
  • п. 11.

  • Лизис ядер. Требования, предъявляемые в п.11 противоречивы. Для того, чтобы получить полный лизис, требуется хорошо смешать суспензию ядер с раствором II, однако, интенсивное смешивание грозит дроблением геномной DNA. Мы поступаем следующим образом:
    1. непосредственно перед внесением (<1') Buf.II вновь взболтать суспензию ядер: вортекс - 2-4'';
    2. быстро внести Buf.II; сразу же закрыть пробирку; резко встряхнуть 2-3 раза. Для того, чтобы вскрыть ядра, раствору с SDS требуется несколько секунд. надо уложиться со встряхиванием в это время;
    3. через ~1' медленно перевернуть пробирку 2-3 раза.
  • Можно хранить 1-2 дня при 4oС.
  • п. 12.

  • Расщепление белков ProtK.
  • п. 13.

  • Экстракция должна быть мягкой, для того, чтобы не раздробить механически длинную геномную DNA. Мы проводим её либо покачивая пробирку (+45o) ~10' с частотой ~11/сек, либо вращая их вокруг своей оси ~0.5-11/сек
  • п.14.

  • Центрифугирование после первой экстракции органическими растворителями выполняются в два этапа, т.к. оставшиеся в растворе крупные частицы (не лизировавшие ассоциаты ядер, ...) при быстром центрифугировании могут увлечь с собой или повредить геномную DNA.
  • п.16.

  • Осаждение EtOH требует меньшей работы и выполняется существенно быстрее, чем диализ, но размер DNA получается при этом заметно меньше. Из-за трудоемкости, диализ стоит применять только в том случае, если планируется использовать DNA для создания геномной библиотеки. Для всех остальных применений вполне достаточно осаждения EtOH.
  • п. 19.

  • Стоит иметь ввиду, что замораживание-оттаивание уменьшает размер DNA, а долгое хранение при 4oС чревато заростом, поэтому нужно стараться использовать DNA после диализа как можно скорее.
  • Диализ
  • Диализ: диализный мешок нужно сполоснуть H2O и зажать клипсом один его конец. Нужно как-то пометить этот конец, т.к. после диализа именно через него нужно сливать DNA (на другом конце внутри клипса сохранится неотдиализованная => грязная DNA). Мы проводим диализ в конструкции, показанной на рисунке. Держатель, изготовленный из пластиковой одноразовой бактериальной петли крепится на банке скотчем.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100