Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Сиквенс > Приготовление геля и форез. Прибор фирмы BioRad.

Приготовление геля и форез при использовании сиквенсового прибора фирмы BioRad.

Приготовление геля и форез при использовании сиквенсового прибора фирмы BioRad. Для получения более общей информации можно посмотреть этот протокол.


  1. Помыть термоплату и стекло, сполоснуть дистиллятом, поставить сушиться;
  2. Приготовление геля.

  3. Смешать:
     Бис-акриламид0.18g
     Акриламид3.33g
     Мочевина29.4g
     H2Oдо 70ml
     10xTBE7ml;
  4. Подогреть раствор в микроволновой печке 15'' (примерно, до 30oC), помешивать до полного растворения;
  5. Профильтровывать через 0.45µm фильтр, поставить на дегазацию;
  6. Подготовка термоплаты.

  7. Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности термоплаты;
  8. Растереть марлей 5ml Repel-silane по поверхности термоплаты;
  9. Повторить предыдущий пункт;
  10. Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности термоплаты;
  11. Сухой марлей отполировать поверхность;
  12. Подготовка стекла.

  13. Растереть марлей 5ml EtOH по поверхности стекла;
  14. Сухой марлей отполировать поверхность;
  15. Подготовить раствор Bind-Silan:
  16.  EtOH5ml
     Уксусная кислота125µl
     Bind-Silan1µl
  17. Нанести 50µl этой смеси равномерно по всей ширине стекла по нижнему краю;
  18. Нанести типом 50µl этой смеси равномерно по всей ширине стекла, отступив 2-3см от верхнего края;
  19. Когда смесь подсохнет, отполировать марлей область нанесения;
  20. Заливка "пробки".

  21. Собрать стекло с термоплатой, положить горизонтально;
  22. В 15 ml нунке смешать:
     Гель5ml
     PSA 10%50µl
     TEMED5µl
  23. Залить с нижней стороны геля "пробку" примерно 2см шириной;
  24. Заливка геля.

  25. В карман для верхнего буфера налить дистиллированной воды, примерно 200ml;
  26. К гелю после дегазации добавить и смешать:
     PSA 10%300µl
     TEMED30µl
  27. Поставить сиквенсовый прибор вертикально, 10ml пипеткой залить гель;
  28. Положить гель почти горизонтально, так чтобы верхняя сторона была на 2-3см выше нижней;
  29. Вставить гребенку обратной стороной, зажать область гребенки двумя "бульдогами";
  30. Отлить 0.5-1ml геля в эппендорф (для контроля полимеризации геля);
  31. Вылить воду из кармана для верхнего буфера, снять зажимы, не вынимая гребенки, сполоснуть верхнюю часть геля дисстиллятом;
  32. Форез.

  33. Установить залитый гель в поддон для нижнего буфера;
  34. Прогреть гель, дважды наливая в карман для верхнего буфера 500 ml нагретого дистиллята( ~55oC);
  35. Налить в карман для верхнего буфера 500 ml нагретого 1xTBE( ~55oC);
  36. Налить в карман для нижнего буфера 500 ml не нагретого 1xTBE;
  37. Вынуть гребенку, промыть карман шприцом с надетым на него желтым носиком;
  38. Включить префорез, 20'. Мощность тока 65W, температура 52oC;
  39. Промыть карман, вставить гребенку;
  40. Денатурировать образцы 3', 95oC;
  41. Нанести по 3µl на сиквенсовый гель;
  42. Включить форез. Мощность тока - 5W, температура 52oC;
  43. Когда образцы войдут в гель (~10'), переключить мощность на 65W, температура 52oC;
  44. Фиксация и сушка геля.

  45. Положить стекло с гелем на 1h в 10% уксусную кислоту;
  46. Переложить стекло с гелем на фильтровалку, отрезать скальпелем верх и низ геля;
  47. Положить влажный кусок Whatmann 3MM на поверхность геля, вместе с гелем снять ватманн со стекла;
  48. Накрыть гель пленкой "SaranWrap", сушить на гель-драере 2h;
  49. Заложить на экспозицию, проявить;


    Комментарии.

    Общие.

  • Фирма BioRad выпускает сиквенсовые приборы двух разных видов. Ширина стекла в одном из них 21см, в другом 38см. Соответственно, на широкий гель можно нанести в два раза большее количество проб. В зависимости от ширины дорожки, на узкий гель можно нанести 9-12 сиквенсов. Данный протокол - для узкого сиквенсового прибора. В случае использования широкого сиквенсового прибора, следует увеличить объем геля до 150ml, мощность тока также следует увеличить в два раза.
  • На фотографии приведен широкий сиквенсовый прибор.
  • По пунктам.

    п. 2.

  • Для сиквенсового прибора шириной 38см, следует увеличить все объемы в два раза.
  • п. 19.

  • Если при заливке геля, акриламид случайно затечет в карман для верхнего буфера, то он там не заполимеризуется, а растворится в воде.
  • п. 31.

  • Для сиквенсового прибора шириной 38см, мощность тока 130W.
  • п. 35.

  • Для сиквенсового прибора шириной 38см, мощность тока 10W.
  • п. 36.

  • Для сиквенсового прибора шириной 38см, мощность тока 130W.
  • п. 37.

  • С гелем следует обращаться достаточно осторожно. К стеклу от прилеплен только теми областями, которые были обработаны Bind-Silane. Эти области могут оторваться и средняя часть геля отвалится от стекла.
  • п. 38.

  • Следует отрезать те области, которые были обработаны Bind-Silane.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100