Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Сиквенс > Сиквенсовая реакция с использованием CycleReader Kit.

Cиквенсовая реакция с использованием CycleReader Kit.

Постановка сиквенсовой реакции с использованием CycleReader DNA Sequencing Kit фирмы Fermentas (#K1711).

  1. Раскапать в подписанные PCR пробирки по 2µl терминаторных смесей A, C, G, T;
  2. Поставить в лед;
  3. В ледяную баню поставить новую 0.5ml пробирку, в ней смешать:
     Сиквенсовый буфер4µl
     Праймер (10pmol/µl)1µl
     ДНК30-100fmol
     a[33P]dATP1µl
     Полимераза1µl
     H2Oдо 30µl
  4. В каждую пробирку A, C, G, T из п.1 добавить по 6µl смеси из п.3;
  5. Переставить пробирки в предварительно прогретый до 94oC PCR прибор;
  6. Провести PCR:
     94oC   3'
    25 циклов:
     94oC   30''
     __oC   30''   (температура зависит от последовательности праймера)
     72oC   60''
  7. Поставить пробирки в лед;
  8. В каждую пробирку добавить по 4µl STOP буфера;

  9. Перед нанесением на сиквенсовый гель денатурировать 3' при 95oC;
  10. Нанести по 3µl на сиквенсовый гель.

    Состав кита.

  • ReaderTM Taq DNA Polymerase 2u/µl
    110µl
  • Sequencing Buffer

  • 440µl раствора, содержащего Tris-HCl, KCl, MgCl2, Nonidet P40
  • Termination Mix A
    220µl раствора, содержащего 7-deaza-dGTP, dATP, dTTP, dCTP, ddATP
  • Termination Mix C
    220µl раствора, содержащего 7-deaza-dGTP, dATP, dTTP, dCTP, ddCTP
  • Termination Mix G
    220µl раствора, содержащего 7-deaza-dGTP, dATP, dTTP, dCTP, ddGTP
  • Termination Mix T
    220µl раствора, содержащего 7-deaza-dGTP, dATP, dTTP, dCTP, ddTTP
  • M13/pUC Sequencing Primer (-46)
    110µl, 10µM, 5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3'
  • M13/pUC Reverse Sequencing Primer (-46)
    110µl, 10µM, 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'
  • Stop Solution
    3ml формамида, содержащего бромфеноловый синий, ксилен цианол, EDTA.
  • Control DNA
    25µl pUC19, 0.2µg/µl
  • T4 Polynucleotide Kinase, 10u/µl
    40µl
  • T4 Polynucleotide Kinase Buffer
    100µl
  • H2O, mQ
    1.5ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "CycleReader DNA Sequencing Kit User Manual", Fermentas.
  • Отличный кит для постановки сиквенсовых реакций. Можно сиквенировать PCR-продукты, плазмиды, космиды, ДНК фага лямбда. Кит очень прост в освоении. С помощью этого кита сиквенсы получаются с первого раза даже у тех людей, которые до этого не имели опыта сиквенирования.
  • Описание на сайте фирмы Fermentas.
  • Кит рассчитан на 100 сиквенсовых реакций.
  • По пунктам.

    п. 3.

  • В этом ките обычно первой заканчивается полимераза. В этом случае мы используем Taq полимеразу 2u/µl в качестве замены, пока не закончатся терминаторные смеси в ките.
  • п. 6.

  • 30-100fmol это примерно 0.1-0.3µg для плазмиды длиной 5kb. Для перевода молей в массу можно воспользоваться этой программой на нашем сайте.
  • Температуру отжига праймера рассчитывать как для обычного PCR.
  • п. 8.

  • После добавления STOP буфера, сиквенсовые реакции можно хранить при -20oC около двух недель.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100