Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Сиквенс > Сиквенсовый гель и форез.

Приготовление сиквенсового геля и форез.


    Подготовка стёкол.

    Гель будет сушиться на стекле.

  1. старый гель снять, вымочив ~0.5h в 0.5N NaOH (или КOH);
  2. мыть порошком (или хромпиком, если пластины давно в использовании, новые или из ненадежных рук);
  3. сполоснуть H2O, дать стечь, подсушить EtOH;
    • т.к. bind-silane очень летучее вещество и даже небольшого его количества достаточно, чтобы приклеить гель к стеклу, то:
    • * вначале обработать "неудобную" пластину (например, пластину "с ушами") repel-silane, затем "удобную" - bind-silane,
      * следить, чтобы перчатки и бумага, соприкасавшиеся с bind-silane не дотрагивались до repel-пластины,
      * сэндвич из пластин собирать непосредственно перед заливкой.

    • мы используем для полировки 1/4 листа А4 хорошей писчей бумаги. Ее нужно резать ножницами, а не рвать, чтобы не появлялось ворсинок.

    Для пластин размером 50x20сm2:

    Repel-silane.

  1. распределить по поверхности 5ml Repel silane, подсушить, отполировать;
  2. повторить п. 4;
  3. сполоснуть EtOH;
  4. подсушить, отполировать.
  5. Bind-silane.

  6. равномерно распределить по поверхности 5ml смеси:  
  7. EtOH => 5ml,  
    уксусная кислота => 125µl,  
    Bind-silane => 19µl;  

  8. подсушить, отполировать;
  9. сполоснуть EtOH;
  10. подсушить, отполировать.
  11. гель будет сушиться на 3мм.

  12. мыть порошком (или, если пластины давно в использовании, новая или из ненадежных рук - хромпиком);
  13. сполоснуть H2O, дать стечь, подсушить EtOH;
  14. "неудобную" пластину обработать Repel-silane; "удобную" - не трогать.
  15. Приготовление геля.

    • Лучше не пользоваться готовыми растворами т.к. в твердом виде отдельные компоненты лучше хранятся.
    • Даже жидкости удобнее фасовать на весах.
    • Твердые вещества взвешивать в одну и ту же кювету (начинать с маленьких количеств, заканчивать большими: BIS->AA->Urea.)
    • Мы используем гель с формамидом только для сиквенса проблемных областей (в сочетании с 7-deaza dGTP), так как на геле без формамида полосы чётче и его удаётся читать дальше).
  16. гель (5%) с формамидом:
  17. 50ml 100ml 70ml 80ml
    Мочевина 21g 42g 29.4g 33.6g
    Акриламид 2.38g 4.75g 3.33g 3.8g
    ВIS-АА 0.13g 0.25g 0.18g 0.2g
    Формамид 17.5ml
    19.78g
    35ml
    39.55g
    24.5ml
    27.69g
    28.0ml
    31.64g

    H2O 12.3ml 24.6ml 17.22ml 19.68ml
    Ионообменная смола* ~2.5g ~5g ~3.5g ~4g

    (5%)без формамида:

      50ml 100ml 70ml 80ml
    Мочевина 21g 42g 29.4g 33.6g
    Акриламид 2.38g 4.75g 3.33g 3.8g
    ВIS-АА 0.13g 0.25g 0.18g 0.2g
    H2O 29.8ml 59.6ml 41.72ml 47.68ml
    Ионообменная смола* ~2.5g ~5g ~3.5g ~4g

    * обычно необязательно.

  18. деионизовать (обычно необязательно): перемешивать 0.5h; отфильтровывать через 0.45µm фильтр;
  19. добавить:
  20. GTGB 20x 2.5ml 5.0ml 3.5ml 4.0ml
  21. дегазировать: >15' - без встряхивания, >10' - со встряхиванием.
  22. добавить в указанном порядке непосредственно перед заливкой геля:
  23. PSA 10% свежий 250µl 500µl 350µl 400µl
    TEMED 25µl 50µl 35µl 40µl
    • Растворение мочевины - эндотермическая реакция. Чтобы она шла быстрее - лучше раствор подогревать (можно использовать Microwave), но не нагревать выше 30-35oС, иначе при дегазировании раствор будет кипеть слишком бурно.
    • Если PSA добавляется твердым, во избежании образования маленьких сгустков геля нужно растворить его вместе с мочевиной и только затем добавлять АА и BIS-AA.
      Если раствор геля будет использован сразу после приготовления - PSA можно добавлять заранее.

    Объемы геля.

    пластина: Vготовить Vрасходуется
    50x20 см2 50ml ~35ml

    Заливка.

  24. если имеются только ровные спейсеры, а нужны клинообразные - подклеить 5 слоев paper tape (уменьшающейся длины) или два куска спейсера (для 50cm пластин ~10cm и ~5cm);
  25. Изготовление клинообразных спейсеров
  26. заклеить 3 стороны непрерывным куском "yellow tape";
  27. зажать стекла бульдогами (верхнюю часть зажимать не надо, иначе гребенка не влезет);

  28. клинообразный гель
    (самодельные спейсеры):
    клинообразный (фабричные спейсеры)
    или плоский гель:

    Расположение бульдогов на стеклах

  29. залить гель 50ml пластиковым шприцом. (после использования сполоснуть шприц водопроводной водой и дистиллятом. Не мыть детергентами (!) так как смывается смазка с поршня);
  30. вставить гребенку, зажать ее бульдогами;
  31. полимеризация >1h (оптимальная температура полимеризации ~23-25oС. В оптимальном случае гель застывает за 8-10'. Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации. Если важна воспроизводимость, лучше выдержать гель 2h при NT;
  32. гель можно хранить несколько суток при 4oС. Для этого на стеклянный карман нужно положить фильтровалку, смоченную буфером и плотно замотать верхнюю часть Saran wrap.
  33. Форез.

  34. немедленно после извлечения гребенки сполоснуть карман (5ml шприцем);
    • Гребёнку "акульи зубы" лучше вставлять сразу, как только освободится карман. Через некоторое время (возможно из-за разогрева при префорезе) толщина геля может уменьшиться;
    • Опасно на одном и том же геле делать два прогона, т.к. через 1-2h фореза гель может слегка отслоиться в верхней части;
  35. префорез ~15';
    • Оптимальная температура фореза ~55oС;
    • Мощность для 50х20cm2 геля (клинообразный: 0.4-0.6mm) ~75 W.
    • Наносить на гель образцы (естественно, все четыре буквы - рядом) лучше блоками "через один". Например, сначала нанести все нечётные матрицы и вогнать их в гель приблизительно на 3-5mm, а затем нанести чётные. При этом между блоками появляется небольшой зазор, который облегчает чтение геля.
    • На "первый" прогон лучше использовать клинообразные спейсеры, на "второй" - только плоские(!) (использование на "втором" прогоне клинообразных пластин практически не улучшит равномерность расстояния между полосами геля, но зато приведёт к весьма ощутимому уменьшению "эффективной длины " геля, в результате с геля можно будет прочитать заметно меньше полос).

    Подвижность красителей в PAAG (денатурирующий):

    % АА Бромфеноловый синий [bp] Ксилен. цианол. [bp]
    5% 35 130
    6% 26 106
    7% 22 88
    8% 19 70-80
    10% 12 55
    20% 8 28

    Послефорезная обработка.

  36. фиксировать до практической отмывки красителей (можно оставить ON) в растворе:
  37. 10% уксусная к-та,
    10% EtOH;

    толщина геля: время фиксации:
    0.2mm ~5'
    0.4mm ~15'
    0.4-1.2mm ~60'

    Гель на стекле.

  38. вытащить из фиксирующего раствора,
  39. 1 раз промакнуть фильтровалкой;
  40. сушить феном;
  41. Гель на 3ММ.

  42. наклонить гель;
  43. дать стечь лишней жидкости;
  44. перенести гель на 3ММ;
  45. сушить - на гель-драере (чем лучше насос, тем выше может быть температура сушки без опасности, что гель растрескается);
  46. Автограф.

  47. лучше при -70oС. Либо экспонировать через saran-wrap, либо перед закладкой плёнки посыпать гель тальком.

    Растворы.

    GTGB

    20x /Glycerol tolerant gel buffer/ (хранить+4oС):

    Конц.Сток1L1.5L2.0L2.5L

    Tris base

    1.78M121.14g/M216g324g432g540g

    Taurine

    0.56M125.15g/M72g108g144g180g

    Na2EDTAx2H2O

    10.7mM372.3 g/M4g6g8g10g

    H2O

     mQ802ml1203ml1604ml2005ml

    p=1.094


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100