Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > PCR > Клонирование PCR продуктов.

Приготовление Т-вектора.

Для приготовления Т-вектора используется вектор, разрезанный рестриктазой EcoRV, дающей тупые концы. Инкубация с Taq pol. и dTTP добавляет 3'-концевую Т. Самолигирование изменяет размер тех молекул вектора, которые по каким-либо причинам не приобрели 5'-концевую Т. Размер молекул с двумя 3'-концевыми Т не изменяется и это позволяет очистить их с помощью препаративного электрофореза.

    Приготовление вектор/EcoRV.

  1. собрать смесь:
  2. вектор => 10µg
    "B" буфер(10х) => 20µl
    BSA(10х) => 20µl
    EcoRV => ~20u
    H2O => до 200µl

  3. 37oC, 1-2h;
  4. 2µl на форез - проконтролировать полноту рестрикции;
  5. экстракция 200µl Ф:Х, Х;
  6. добавить
  7. NaCl (5M) => 8µl
    EtOH 96% => 500µl

  8. N.T. 10';
  9. ЦФ NT, 10';
  10. сполоснуть 70% EtOH;
  11. растворить в 88µl H2O.
  12. T-extension.

  13. добавить
  14. Taq buffer (c 2.5mM MgCl2) => 10µl
    dTTP (100mM) => 2µl
    Taq pol => 5u

  15. 72oC, 2h;
  16. охладить до NT, экстрагировать Ф:Х, Х;
  17. NaCl (5M) => 4µl,
    EtOH (96%) => 250µl;

  18. NT, 10';
  19. ЦФ NT, 10';
  20. сполоснуть 70% EtOH;
  21. растворить в 45µl H2O.
  22. Самолигирование.

  23. добавить
  24. T4 lig. buf.(10х) => 5µl,
    T4 DNA lig. => 2u;

  25. 16oC, ON;
  26. препаративный форез в 0.8% агарозе;
  27. выделить незалигировавшуюся pDNA в PEG;
  28. разаликвотить по 15µl, хранить при -20oС.


    Комментарии.

    Общие.

  • Taq полимераза способна добавлять один нуклеотид к тупому концу DNA. Если доступны все четыре dNTPs она предпочитает использовать для этого dATP. Но, если предоставлен только один d(G,C,T)TP, она использует его, хоть и менее эффективно, чем dATP.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100