Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > PCR > Устранение загрязнений.

Борьба с загрязнениями при PCR.


    Наиболее распространённый способ - UV облучение.

  • Чувствительность к облучению различных компонентов PCR-реакции:
  • dNTP'sпрактически нечувствительны
    Primer'sзаметно чувствительны (зависит от последовательности и концентрации)
    Taq polвесьма чувствительна (5u/µl Taq pol теряет 50% активности за 6' облучения на Stratalinker)
  • dNTP's сильно поглощают UV. Если проводить облучение PCR-mix без dNTP's, то для достижения того же эффекта требуется ~ в 30 раз меньшее время облучения.
  • Облучение лучше проводить в растворе, так как сухая DNA в ~5x103 раз менее чувствительна к облучению, чем влажная.
  • Механизм инактивации DNA не очень понятен, так как эффективность инактивации не коррелирует ни с количеством пиримидиновых димеров, ни с длиной фланкирующей DNA (межцепочечные сшивки). Присутствие EtBr также не влияет на эффективность инактивации.
  • Облучение ~5' на Stratalinker приводит к падению эффективности PCR на 750bp фрагменте в ~106 раз. Интенсивность облучения практически линейно падает с увеличением расстояния от ламп Stratalinker.
  • Длинные фрагменты DNA более чувствительны, чем короткие. Чувствительность довольно резко растёт до ~700bp, затем скорость роста снижается.
  • Относительная чувствительность:

    209bp1
    551bp125
    2277bp1000

    Загрязнения поверхностей можно устранить 1' обработкой гипохлоридом Na.


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100