Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > PCR > Влияние различных веществ на PCR.

Влияние различных веществ на PCR.

Указаны значения, при которых присутствие этих веществ не сказывается на PCR.

    Красители.

    Cresol red0.2mM
    Tetrazine dye yellow food coloring (Schilling Brand)1-2%
    Ксилен цианол<20µg/ml*
    Бромфеноловый синий<20µg/ml
    EtBr~ 0.1µg/ml

    * по другому источнику : 160 µg/ml.

    Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции.

  • Важно отметить, что добавление этих веществ к уже оптимизированной и хорошо идущей реакции может вызвать ухудшение выхода. Это не удивительно - указанные вещества изменяют взаимодействие между праймерами и матрицей и между матрицей и полимеразой, и в случае хорошей реакции эти изменения скорее всего дадут отрицательный эффект.
  • Вещество:    Сток:   Используемые концентрации:Механизм действия:
    Acetamide25%~5%повышение растворимости
    Betain Na5M0.5-2M
    (оптимально ~1.6M)
    стабилизация фермента, понижение Tm DNA, выравнивание Tm AT- и GC-богатых последовательностей
    BSA10 µg/ µl~0.1 µg/mlстабилизация фермента
    DMSO100%2.0-15%
    (оптимально ~5%)
    повышение растворимости
    Formamid100%1-5% 
    Glycerol100%5-20%
    (оптимально10-15%)
    стабилизация фермента
    NP-40, Tween 20, Triton X-10010%0.1-0.5%

    (улучшает seq. PCR)
    стабилизация фермента
    PEG 800040%5-20%
    (оптимально - 15%)
    повышение эффективной концентрации
    Tetramethylammonium chloride (TMA chloride)5M0.01-0.1mMповышение специфичности
    Pyrophosphatase thermostable5 u/µl0.001-1u/реакциюустранение пирофосфатов, которые могут обращать реакцию полимеризации
    ssDNA binding protein E.coli500 µg/ml5 µg/mlстабилизацияssDNA
    ssDNA binding protein T4 gene 32 protein500 µg/mlулучшает выход в концентрациях 0.5-1.0mM.стабилизация ssDNA
  • Из статьи "Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res 2000 Jul 1;28(13):E70" В скобках – концентрация веществ, приводящая к указанному эффекту. Число перед скобками означает относительную эффективность действия. Специфичность оценивается как доля DNA, приходящаяся на специфическую полосу.
  • TMA производные практически не изменяли оптимальную температуру отжига.
  • Вещество Максимальная 90% ингибирование
    эффективностьспецифичность
    TMA chloride1.9(5 mM)0.5(20 mM)(35 mM)
    TMA oxalate2.2(2 mM)1.0(2 mM)(9 mM)
    TMA acetate1.0(<10 mM)0.4(20 mM)(40 mM)
    TMA hydrogen sulfate1.2(0.5 mM)1.0(50 mM)(70 mM)
    Ammonium chloride1.0(<20 mM)0.2(<20 mM)(50 mM)
    Benzyldimethylhexadecylammonium chloride1.1(0.2 mM)0.4(1 mM)(1.0 mM)
    HTA bromide1.2(0.05 mM)0.5(0.5 mM)(0.8 mM)
    HTA oxalate1.0(<0.2 mM)0.28(<0.2 mM)(0.5 mM)
    Betaine monohydrate1.1(100 mM)0.4(750 mM)(900 mM)
    Dimethyl sulfoxide1.0(<1.4 M)0.6(1.4 M)(1.6 M)
    Formamide1.4(0.5 M)0.8(1 M)(2.0 M)
    PCR без добавок1.00.2 

    Детергенты.

    Неионные 
    NP-40>5% v/v
    Tween-20>5% v/v
    TritonX-100>5% v/v
    N-octylglucoside<0.4% w/v
    Ионныеотрицательный эффект до некоторой степени может быть скомпенсирован добавлением неионных детергентов
    SDS<0.01% w/v; 0.005% w/v снижает выход ~ в 2 раза;
    Na desoxycholate<0.06% w/v
    N-Lauroylsarcosine Na<0.02% w/v

    Другие вещества.

    Агарозане мешает до ~1%.
    АА акриламид линейныйне мешает (по крайней мере в низкой концентрации).
    AcONa (pH 5.0)начинает ингибировать при>5mM.
    BSA ацетилированный10µg/ml - ингибирует.
    BSA heat инактивированный10µg/ml - не мешает.
    Vanadil ribonucleoprotein complexesингибируют при > 0.4mM; не мешают при <0.04mM (когда цвет 8-гидроксихинолина в феноле не изменяется при экстракции - уже не ингибируют)
    Гемоглобин (концентрация в крови ~160mg/ml)уменьшает выход при >1mg/ml.
    Гепаринингибирует (используется для предотвращения свертывания крови 14.3 u/ml, не устраняется органическими растворителями и переосаждением).
    Ингибирует PCR при >0.15U/ml.
    EDTAсвязывается с Mg2+ стехиометрически, начинает ингибировать при >0.5mM, PCR не идёт при 1mM.
    DEPCингибирует реакцию, лучше не использовать в PCR-реакции растворы, обработанные DEPC.
    Желатин10µg/ml - не мешает.
    Изопропанолингибирование при концентрациях >1% (более сильный ингибитор, чем этанол).
    Масло, покрывающее PCRможет устранять ингибирующий эффект некоторых загрязнений.
    Мочевина (в моче ~350mM)на разные реакции - по разному, в среднем, начинает ингибировать при >20mM.
    NaClзаметно ингибирует при 25mM, PCR не идёт при 50mM.
    RT смесьне влияет на PCR реакцию при концентрации 10%, начинает ингибировать при >15%.
    RNAингибируют (>0.5µg на 20µl PCR); ингибирующий эффект можно устранить добавлением в реакцию RNase (термостабильна).
    Сахарозане мешает до 30%.
    Фенолуменьшает выход при >0.2%, PCR не идёт при 0.5%.
    Ficoll 400не мешает до 1% (выше - ингибирует).
    HxPO4Mg3(PO4)2 - образует преципитат при NT, если >0.25mM (в PBS - HxPO4~9.3mM).
    Этанолдля некоторых реакций - стимулирующий эффект при 1%, для других - ингибирование при концентрациях >1%.
    Хлороформне влияет на PCR реакцию даже при концентрации 5%.
    Цитрат Naне оказывает влияния при 1mM.
    МеланинЗаметно от 0.01µg/µl, ингибирует: 0.08µg/µl.
    Polyvinilpyrollidon (PVP)не ингибирует по крайней мере до 2%
    Мембраны:
    Nitrocelluloseингибирует PCR
    Cellulose acetateингибируетPCR
    Fluroporeне ингибирует PCR
    Duraporeне ингибирует PCR

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100