Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > PCR > Компоненты PCR смеси.

Состав PCR реакции.


    Состав обычной PCR реакции.

    Конц.Сток100µl
    Буфер10х10µl
    MgCl2 (1-4mM)2.5mM25mM10µl
    dNTP’s (50-200µM)0.2mM10mM2.0µl
    Primer#1 & #2по 0.1µM10µMпо 1µl
    Polymerase0.05u/µl5u/µl1µl
    Матрица  ??
    Буфер для внесения20µl
    H2O mQдо 100µl 
  • Иногда в реакцию дополнительно вводятся различные вещества, которые улучшают специфичность (увеличивают выход).
  • PCR buffer 10x

    (хранить при +4oC):

    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%100%
    p=1.108
    5.0ml
    5.54g

    H2O mQ112.5ml
    Конц.Сток500ml
    Tris Cl, pH 8.6*0.5M1M250ml
    KCl0.5M2M125ml
    MgCl215mM1M7.5ml
    Tween 201%10%50ml
    H2O mQ67.5ml

    p (10x Buf.) = 1.018 g/ml
    * - другой способ: 175ml (1M Trise-base) + 75ml (1M Trise-HCl).

    10х Буфер №2

    хранить при 4oС, p=1.022:

    Конц.Сток25ml300ml500ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M2.5ml30ml50ml
    KCl0.5M2M6.25ml75ml125ml
    Triton X-1001%10%2.5ml30ml50ml
    H2O mQ13.75ml165ml275ml
    Конц.Сток25ml300ml500ml
    Tris Cl, pH 9.00.1M1M2.5ml30ml50ml
    KCl0.5M2M6.25ml75ml125ml
    Triton X-1001% 100%
    p=1.06
    0.25ml
    0.258g
    3.0ml
    3.09g
    5.0ml
    5.15g

    H2O mQ16.0ml192ml320ml

    Буфер для внесения

    5x, (хранить при 4oС)

    Конц.Сток100ml
    Сахароза60%тв.60g
    Cresol red0.25mM50mM0.5ml
    H2O mQ59.5ml

    p=1.2.

    3.33x, (хранить при 4oС)

    Конц.Сток%(w/w)100ml200ml700ml
    Betaine Na5M135.2g/M63.0067.6g135.2g473.2g
    Cresol red333µM50mM0.31333µl667µl2.33ml
    H2O mQ36.6939.37ml78.73ml275.6ml

    p~1.073g/ml

    PCR буфер 2.5х

    (хранить при +4oС)

    Конц.Сток100ml300ml
    Buffer (15mM MgCl2)2.5x10x25ml75ml
    Betaine3.75M5M74.75ml224.25ml
    Cresol red125 µM50mM250µl0.75ml

    p (2.5x buffer) = 1.06g/ml

    MgCl2

    25mM:

    Конц.Сток50ml
    MgCl225mM1M1.25ml
    H2O  48.75ml


    Комментарии.

    По отдельным компонентам.

    Буфер.

  • Tris Cl. Высокое значение рН берется из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает (температурный коэффициент ~ -0.031ед. рН/oC) и при 72oС составляет ~7.5.
  • KCl. Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq полимеразы (но 0.2M - полностью ингибирует полимеразную активность).
  • Triton X-100. Предотвращает адсорбцию белка на поверхности пробирки.
  • MgCl2.

  • Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM (10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%). Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность PCR: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.
  • Т.о. слишком низкая концентрация Mg2+ - низкий выход, слишком высокая - множество полос неспецифической амплификации.

  • На молекулярном уровне: Mg2+ образует комплексы с dNTP’s (именно эти комплексы являются субстратом для Taq pol). C Mg2+ стехиометрически связываются dNTP’s, PPi, EDTA, PO4. Повышение концентрации Mg2+ вызывает повышение температуры плавления DNA.
  • dNTP’s.

  • Важно поддерживать концентрацию значительно выше, чем Km соответствующей полимеразы. Меньшие концентрации dNTPs - более высокая точность синтеза. Диапазон используемых концентраций 50-500 µM.
  • Количество: Если в 100µl реакции включится 50% dNTP’s, то количество продукта составит: m=50[%]x4[dNTP’s]x50[µM]x300[g/M]x100[µl]=3µg.
  • Важно иметь ввиду, что, т.к. dNTP’s обладают значительной буферной емкостью, сток dNTP’s должен иметь нейтральный рН.
  • Приготовление стока - "Однокомпонентные растворы".
  • Primer’s.

  • Необходимое для реакции количество праймера совсем несложно оценить: если в 100µl будет синтезировано 3µg 500bp продукта, то на это должно пойти праймера: m=3[µg]/{300[g/M]x500[bp]x2[цепи]}=10pmol. Используемый диапазон концентраций: 0.1-0.6 µM.
  • Лучше, если пара "сбалансирована", т.е. разница температур плавления не превышает 2-4oС.
  • Непроверенная информация A-T - клонирование.
  • Мы всегда полагали, что Taq-pol добавляет А к любому тупому концу, но есть статья, где сообщается, что это зависит от 3'-конца. Добавляется:

    G - если на 3'-конце G;
    A - если на 3'-конце C, T, A, причем весьма плохо, если последний нуклеотид A.
    => Лучше, если праймеры не начинаются на С или Т.

  • Хранение: иногда при длительном хранении на 4oС (или после большого количества замораживаний-оттаиваний) праймер "портится" - PCR с его участием даёт очень низкий выход. Мы не знаем, что при этом происходит, но проблема вполне решается 3х минутным кипячением и резким охлаждением.
  • Polymerase.

  • Свойства различных полимераз описаны в "Свойства DNA полимераз".
  • Количество.
  • Taq pol.

    Если используется слишком маленькое количество Taq, выход продукта снижается, причем это снижение тем серьезнее, чем больше размер продукта. Не стоит использовать и слишком большой избыток Taq pol. При этом вначале появляются высоко- и низкомолекулярные шмеры (превышение ~2-4 раза), а затем весь продукт становится чрезвычайно маленьким (превышение ~4-16 раз).

    Pfu pol.

    Оптимум концентраций для Pfu polymerase существенно уже, чем для Taq. В случае (весьма редком), когда требуется провести амплификацию с Pfu pol. мы предпочитаем сразу ставить небольшой ряд разведений.

  • Для рутинного использования мы предпочитаем смесь Taq:Pfu=100:1. Судя по литературе у неё практически такая же, как у Pfu, точность синтеза, и мы убедились, что она не уступает Taq pol. в удобстве использования.
  • Стоит отметить, что полимераза - самый дорогой компонент реакции (если покупать коммерческую), и в то же время его совсем не сложно приготовить в лабораторных условиях и превратить в самый дешевый.
  • 1u Taq соответствует 43fmol белка (для Ampli Taq "Perkin-Elmer"). Ampli Taq. 250 000u - 1 mg, 1u -> 4ng, Mw=94kDa, => 1u=4ng/94 000Da=43x10-3pmol=43fmol.
  • Taq pol. обладает 5'-3' экзонуклеазной активностью. Эта активность может вызвать проблемы, связанные с деградацией 5' концов продукта.
  • Точность Taq-pol зависит от концентрации Mg2+, dNTP’s, сбалансированности dNTP’s, pH. В среднем, частота ошибок чуть ниже, чем 1 замена на 100-300bp.
  • Хорошо известно, что из-за того, что Taq полимераза с высокой частотой включает неправильные нуклеотиды для правильного определения последовательности нужно сиквенировать не одну клонированную матрицу, а несколько. Но!!! Это касается только клонированных PCR-продуктов. Если PCR-продукты сиквенировать непосредственно, то последовательность получается точной, т.к. для того, чтобы обнаружить мутацию, она должна присутствовать в >10% матриц. Это возможно лишь в том случае, если мутация произошла в первом цикле, а матриц при этом было не более 5 штук.

    Матрица.

  • PCR продукт.
  • Достаточно ~ 22-25 циклов, чтобы довести PCR до насыщения, если матрица - другой PCR-продукт, разбавленный в ~ 106раз (учитывая и финальное разведение в самой реакции: например, развести PCR продукт в 16 000 раз и использовать 1µl разведения на 30 µl новой PCR-реакции). Внимание! Такие разведения требуют использования какого-либо агента, предотвращающего неспецифическую сорбцию на стенках пробирки: tRNA или какой-либо совместимой с PCR реакцией DNA в концентрациях ~ 0.1µg/ml.

  • Если используется :
    1. геномная DNA млекопитающих => <0.5-1µg;
    2. геномная DNA бактерий => ~1-10ng;
    3. DNA фага лямбда => достаточно 1µl из 200µl элюции одиночной бляшки;
    4. плазмидная DNA =>
      1. 0.1-1.0µl ночной культуры,
      2. совсем небольшое (на зубочистке) количество материала колонии;
      3. ~50ng очищенной суперскрученной DNA (такое большое количество берется из-за того, что pDNA - кольцевая и при понижении температуры она ренатурирует, не оставляя праймеру шанса связаться с ней. Если хочется уменьшить количество вносимой pDNA, нужно проводить предварительную щелочную денатурацию:
        1. pDNA (V<~4µl) в ТЕ, + 1µl 1N NaOH;
        2. 65-85oC, 5' ;
        3. резко охладить до 0oС или заморозить:
        4. + 1µl 1N HCl.
  • Если DNA перед реакцией переосаждается спиртом, то в качестве соли лучше всего использовать NH4Ac (NaAc может ингибировать PCR-реакцию).
  • Буфер для внесения.

  • Мы обнаружили, что добавление 5x буфера с сахарозой улучшает результаты PCR, не сказываясь существенно на температурах отжига праймеров (по видимому, за счёт стабилизации фермента). Очень удобно использовать буфер, если требуется поставить одновременно целый ряд PCR- реакций, а затем проанализировать их на форезе. Сахароза делает раствор достаточно плотным для непосредственного нанесения, а Крезоловый красный служит цветным маркером (подробности "Агарозный гель-электрофорез").
  • 3.33x буфер с бетаином оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров (добавление сахарозы её не изменяет). В случае праймер-пары M-13/23 & M-13/30 Tamax снизилась с 71oС до 67oС при добавлении бетаина до 1.5M. Кроме того, если использовать 65-72oС как температуру полимеризации, то будут проблемы с A-T богатыми матрицами (мы пользуемся субциклами 59/65oC).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100