Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Олигонуклеотиды > PAAG электрофорез.

Форез олигонуклеотидов.


    Подготовка форезного аппарата.

  1. вымыть камеры детергентом, хорошо ополоснуть;
  2. мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком);
  3. если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол - силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов).

    Количество олигонуклеотидов на дорожку.

  1. - нижний предел:
    • для того, чтобы увидеть (но бледно) по теням или по окрашиванию метиленовым синим достаточно ~0.10µg олигонуклеотида на 3mm ячейку {для 20b нуклеотида: 0.10µg => ~20pmol};
    • если хочется получить чёткую картинку, лучше брать раз в 5 больше;
  2. - верхний предел : разрешение еще приемлимое, если брать ~70µg на 1х0.05 см2 ячейку;
  3. Выбор % геля.

  4. длина олигонуклеотида:
  5. менее 25 => 20%
    25-40 => 15%
    40-100 => 12%

  6. на 12х8х0.07см3 гель требуется ~7ml (лучше приготовить 10ml).

  7. 10ml
    12% 15% 17.5% 20%
    40%AA 3.0ml 
    3.1g 
    3.75ml 
    3.9g 
    4.4ml 
    4.6g 
    5.0ml 
    5.2g 
    H2O 3.0ml  2.25ml  1.6ml  1.0ml 
    10xTBE 1.0ml    1.07g 
    мочевина 4.2g 
    PSA 50µl 
    TEMED*5µl 

    * - добавлять непосредственно перед заливкой;

    Дегазация геля
  8. дегазировать ~5' на струйном насосе;
  9. собрать верхнюю камеру форезного прибора. Вставить (не полностью) гребенку между стеклами;
  10. расплавленную 2% агарозу (в ТВЕ 1x) налить на ровную горизонтальную поверхность. Сразу же установить прибор со стеклами (агароза поднимется между стеклами на ~2mm). "Пролить" агарозой внешние края спейсеров;
  11. к гелю +TEMED, быстро и хорошо смешать, залить между стеклами, опустить гребенку в рабочее положение;
  12. полимеризация ~30';
  13. Форез.

    Заливка геля
  14. собрать форезный аппарат; если верхний буфер примыкает к стеклу, лучше перед заливкой подогреть буфер до ~50oC;
  15. префорез ~30V/cm,~15';
  16. перед нанесением: +1 V 2x буфера; 55oС, 5';
  17. форез ~30V/cm.
  18. После фореза.

    1. окрашивание метиленовым синим:
      1. поместить гель в окрашивающий раствор, ~10-30' на качалке;
      2. отмывать в H2O;
      3. фотографировать.
    2. наблюдение олигонуклеотидов по теням на флуоресцирующей пластинке:
      1. гель завернуть в Saran wrap, положить на флуоресцирующую пластинку;
      2. фотографировать (освещать сверху 260nm UV).

    Растворы.

    TBE

    10x, pH~8.3;(хранить при NT в чистой посуде)

    1x10xСток1L
    Tris base89mM0.89M121.14g/M107.8g
    Boric acid89mM0.89M61.83g/M55.03g
    EDTA, pH 8.02mM20mM500mM40ml
    43.84g

    H2O  mQ863.3ml

    * 10х сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.

    PSA

    Ammonium persulfate 10% (хранить при 4oС несколько недель).

    Стоковый раствор акриламида 40%

    (19:1, p=1.044) (хранить при 4oС несколько месяцев).

    Конц.Сток50ml
    Акриламид38%тв.19g
    BIS-AA2%тв.1g
    H2O mQ32.2ml

    2% агароза в 1xТВЕ

    (хранить на NT несколько месяцев).

    Смесь для окрашивания

    (хранить при NT в защищенном от света месте).

    Конц.Сток100ml200ml
    AcON(pH 5.2)0.5M3M17ml33.3ml
    Met. Blue0.04%тв.
    0.2%
    40mg
    20ml
    80mg
    40ml

    H2O mQ83ml
    63ml
    166.6ml
    126.6ml

    2х буфер для нанесения

    Формамид с одним или несколькими красителями (бромфеноловый синий, ксиленцианол, Orange G) в концентрации 0.01-0.05% (по вкусу). Обычно коммерческий формамид имеет вполне приемлимое качество, но если он желтый, то лучше деионизовать (Многокомпонентные растворы.).

    Конечная концентрация формамида при нанесении может быть от ~50 до ~100%.



    Комментарии.

    Общие.

  • Мы не можем поручится, что описанные ниже проблемы не были связаны с качеством геля, но когда мы пытались разогнать на индивидуальной дорожке (3x0.6mm2) ~40fmol меченных олигонуклеотидов, мы получили фон > сигнала. Если брать большее количество олигонуклеотидов, фон остается приблизительно тем же, а сигнал увеличивается. Видимо проблему так же можно решить добавлением "носителя": tRNA или totalRNA.
  • По пунктам.

    п.3.

  • Силиконизирование - см. "Сиквенс". Пластину из окиси титана тоже можно силиконизировать.
  • п.6.

  • Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.
  • п.8.

  • Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить в ~1.5 раза количество PSA и TEMED).
  • п. 9.

  • Если вставить гребенку после заливки геля, можно сдвинуть прибор и повредить агарозную пробку.
  • п.12.

  • Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.
  • п.13.

  • Если проводить форез при повышенной температуре, будет меньше проблем со вторичной структурой олигонуклеотидов.

    п.15.

  • Лучше (но обычно не обязательно), если олигонуклеотиды наносятся на форез прямо с 55oС.
  • Выбор красителя в 2х буфере. Любой из красителей облегчает нанесение на форез.
  • Бромфеноловый синий и ксиленцианол - (стоковые растворы 1% в H2O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) позволяют иметь представление о том, где в геле находятся олигонуклеотиды определенной длины. Но они могут создавать проблемы при наблюдении олигонуклеотидов.
    OrangeG - (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) идет очень низко, для препаративных форезов лучше использовать именно его (а БФ и КЦ наносить где нибудь у края на пустую дорожку).

  • Подвижность красителей в денатурирующемPAAG.
  • % PAAGXylene cyanolBromphenol blue
    20~28~8
    15~30~9-10
    12~40~11
    10~55~12
    8~76~19
    6~106~26
    5~130~35

    п. 17.

  • Оба метода имеют приблизительно равную чувствительность.
    1. Метиленовый синий можно использовать в концентрации 0.0002-0.04%, чем меньше концентрация красителя, тем дольше идёт окрашивание, но тем короче отмывка. AcONa (pH 5.2) введен, по-видимому, для фиксации олигонуклеотидов в геле. Но быстро окрасить можно и в воде. Окрашивание метиленовым синим легко обратимо. Нужно следить и выбирать для фотографирования оптимальный момент.
    2. В качестве флуоресцирующей пластинки можно (лучше) использовать хромотографическую пластинку: /Merck, Art. 5735, DC-Plastikfolien Kieselgel 60 F254 25 Folien 20x20cm/, усиливающий рентгеновский экран или любую флуоресцирующую поверхность. Удобно запаять пластинку в UV прозрачный пакет (и никогда ее оттуда не вынимать).
  • Еще один удобный способ - окрашивание Etidium Bromide. В гель и буфер нужно добавить EtBr до 0.5µg/ml. Но! Окрашивание EtBr имеет чувствительность ~ Met. Синего лишь для олигонуклеотидов ds > 20bp; ss > 40b. Чувствительность методов окрашивания [µg]:
  •  Met.синийEt Br
    ss16 b0.0510
    20 b0.051
    40 b0.050.01
    ds16 bp0.050.1
    20 bp0.050.05
    40 bp0.005-0.010.005-0.01

    Примечание.

    Подвижность красителей в неденатурирующемPAAG.

    % PAAGXylene cyanolBromphenol blue
    204512
    156015
    127020
    816045
    526065
    3.5460100

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100