Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Разное > Random primer.

Реакция Random primer.


  1. в 1.7ml пробирку поместить:
  2. DNA => 20-100ng,
    (dN)6(10x) => 1.5µl,
    H2O из расчёта суммарного => V=15µl;

  3. 100oС, 1.5-3', сразу в лёд, 1-2';
  4. ЦФ 5-10'';
  5. добавить:

    dC(-) смесь10x => 1.5µl,
    RP-буфер10x => 1.5µl,
    BSA10x => 1.5µl,
    a[33P]dCTP => ?
    Klenow DNA pol. => ~2u

  6. смешать, ЦФ 5-10'';
  7. 37oС, 30-45';
  8. оценить % включения с помощью 10% ТХУ;
  9. добавить
  10. 5µl Stop (10x),
    30µl STE (до 50µl);

  11. чистить на G-50 spin-колонке:
  12. а) ЦФ 1.5krpm, 1',
    б) сбросить элюат,
    в) нанести на колонку RP-смесь,
    г) ЦФ 2.5krpm, 2';

  13. определить % включения "просчитав" колонку.

    Растворы.

    (dN)610x

    50OE (~1.7µg/µl)

    dC(-)смесь

    10x (хранить при -20oС):

    Конц.Сток50µl
    d(A,G,T)TP0.5mM5mM3x5µl3x 
    H2O mQ35µl

    RP-буфер

    10x (хранить при -20oС):

    Конц.Сток100µl1.5ml
    TrisCl (pH7.537C)0.5M1M50µl750µl
    MgCl20.1M1M10µl150µl
    DTT10mM1M1µl15µl
    H2O mQ39µl585µl

    BSA

    10x (хранить при -20oС):

    Конц.Сток500µl
    BSA0.5mg/ml10mg/ml25µl
    H2O mQ475µl

    STOP-буфер

    10x(хранить при NT):

    Конц.Сток1ml1.5ml5ml
    TrisCl, pH7.550mM1M50µl75µl250µl
    NaCl50mM5M10µl15µl50µl
    EDTA5mM0.5M10µl15µl50µl
    SDS0.5%10%50µl75µl250µl
    Salm.sp.DNA50µg/ml10µg/µl5µl7.5µl25µl
    H2O mQ875µl1.31ml4.375ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Суть реакции Random primer: DNA, которая служит матрицей денатурируется, и с ней гибридизуются случайным образом 6-нуклеотидные затравки. DNA-полимераза удлиняет их, используя радиоактивно меченые нуклеотиды.
  • концентрация праймера не оказывает существенного влияния на размер образующихся продуктов.
  • для эффективного синтеза различные матрицы требуют существенно различных концентраций праймера. концентрация, которая используется в методике избыточна для большинства матриц. Избыточность праймера используется для того, чтобы обеспечить более или менее равное мечение различных участков матрицы.
  • Стоит обратить внимание на то, что удельная активность вновь синтезируемой DNA определяется только удельной активностью используемого радиоактивного трифосфата. Количество добавленной в реакцию матрицы роли не играет. Количество добавленной матрицы проявляется в другом:
    1. хватит ли матрицы на то, чтобы израсходовать радиоактивно меченные дезоксинуклеотидтрифосфаты;
    2. в конкуренции с меченной DNA в последующей гибридизации.

    Чтобы получить высокое удельное включение применяются два различных подхода:

    1. Разумный компромисс: в реакцию берётся лишь столько матрицы, сколько требуется для того, чтобы израсходовать радиоактивные трифосфаты. Допустим, взято 10µCi a[32P]dCTP с удельной активностью 3kCi/mmol, следовательно, максимально возможное количество DNA, которое можно при этом синтезировать:
    2. (10µCi х 4х300g/mol) / 3kCi/mmol = 4ng

      Видимо, резонно превысить это количество не более, чем раза в два.

    3. Принципиальное решение проблемы: по окончании реакции матрица отделяется от синтезированной DNA. Для этого перед реакцией матрица либо иммобилизуется на твердом носителе, либо метится фотобиотином.
  • Справочные данные по изотопам можно найти в "Радиоизотопы и флуорофоры".
  • Оценка количества метки с помощью ручного счетчика.
  • Если детектор счетчика практически полностью накрывает Ваш образец, то можно считать, что он захватывает ~40% вылетевших частиц. Допустим, что счетчик показывает 1000Bq (counts per second), тогда под детектором:

    1000[Bq]/3.7x104[Bq/ µCi]/0.4 ~ 0.07 µCi

    По пунктам.

    п. 2.

  • Денатурация матрицы, отжиг 6-членных олигонуклеотидных затравок.
  • п.8.

  • В состав "STOP" входит SDS (чтобы остановить реакцию), Salmon sperm DNA (чтобы предотвратить DNA-специфическую сорбцию на spin - колонке.
  • п.10.

  • Вначале просчитать колонку вместе с элюатом, а затем убрать колонку и просчитать только элюат. Это очень быстрый, но не слишком точный (скорее качественный) метод.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100