Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Разное > Измерение концентрации на спектрофотометре.

Спектрофотометрическое измерение концентрации DNA( RNA)(для DU7500).


    Измерение концентрации DNA/RNA.

  • предел измерения прибора ~0.1µg/ml, т.е. на анализ требуется > 0.01µg. Удобнее пользоваться "маленькой" (100µl) ячейкой. Чтобы кривизна поверхности жидкости не влияла на измерения лучше брать объем образца равным 130µl.
  • С[µg/ml] = А260 x K
  • Если для анализа 1µl образца разбавляется в 130µl буфера, то коэффициент пересчета K1:130OD260 в µg:

     K (для изм. р-ра) [µg/ml]K1:130(для образца) [µg/µl]
    dsDNA506.5
    ssDNA37*4.81
    ssRNA405.2

    * - для олигонуклеотидов коэффициент сильно зависит от состава.

  • На отношение A260/A280(1.8-1.9 - весьма чистая DNA, 1.9-2.0 – RNA) имеет смысл обращать внимание только если измерение проводится в буферном растворе (например, ТЕ) при нейтральном pH.
  • Если совсем строго: {20mM Na фосфат, 0.1M NaCl}. Такие низкосолевые буферы как Tris 10-100mM, pH7.5-9.0; KHPO4100mM, pH8.2, дают очень сходные результаты.
    Измерения в воде приводят к отклонениям до 14% и заниженному A260/A280.

  • При работе с pDNA добавление к чистой плазмидной DNA до 2х кратного избытка RNA приводит к практически линейному сдвигу A260/A280 от 1.9 до 2.1.
  • Точность измерения падает при слишком больших и при слишком маленьких поглощениях:
    A260Точность:
    ~ 0.005~ 18%
    ~ 0.01~ 9%
    0.3-0.7~ 0.3%
    0.1-1.0~ 1.0%
    >2.5лучше не доверять

    Измерение концентрации олигонуклеотидов.

     
  • Молекулярный вес: "Олигонуклеотиды".
  • Молекулярный коэффициент экстинкции.
  • OD - единица измерения количества олигонуклеотидов, соответствует количеству, которое в 1ml на пути 1см дает А260=1 (вес может находится в пределах 20-33µg в зависимости от состава олигонуклеотида. Обычно он ~33µg).

  • Если требуется точный расчет:
  • C [µmol/ml] = OD/Eолигонуклеотида

    Eолигонуклеотида= сумме всех(Eнуклеотидов)

     E [ml/µmol]
    dG7
    dC12
    dA16
    dT9.6
    dN10.8

    Спектрофотометрическое измерение концентрации нукл. кислот.

    Представленная ниже форма поможет расчитать концентрацию нуклеиновых кислот по оптической плотности. Под OD260 понимантся {OD260-OD320}. При пакетном режиме обработки в поле "Поглощение OD260" нужно ввести значения OD260, разделённые пробелами. Объяснение принципа работы формы и подробная инструкция откроется в новом окне при нажатии на эту кнопку:   


     
    Образец:  
     
     
     - отметить для пакетного режима обработки.
     
     
     

    значения по умолчанию
     [µg/ml] - коэффициент для олигонуклеотида       
    Объём ячейки спектрофотометра:   µl
    Объём образца:   µl
    Поглощение OD260:    
      
    Концентрация:       

    Вывод результатов при пакетном режиме обработки:




    Комментарии.

    Общие.

    Два спектра
  • По возможности всегда (особенно в случае низких концентраций) снимайте спектр. Спектр позволяет вам оценить, насколько цифра А260 может отражать концентрацию DNA. Два спектра на рисунке имеют приблизительно одинаковые значение А260, но мы бы не рискнули принимать это значение всерьез для правого образца.
  • Лучше, когда измеряется не А260, а (А260320). Т.к. чистые нуклеиновые кислоты имеют А320=0, это позволяет скомпенсировать (в первом приближении) вклад примесей. Часто такой вычет дает вполне реальные поправки.
  • Следует обращать очень серьезное внимание на те компоненты раствора, которые способны поглощать UV: остатки NaI (после выделения DNA из агарозы), детергенты, EDTA, CsTFA и т.п. Это особенно актуально, когда в качестве контрольного раствора используется H2O.
  • На всякий случай напомним простые вещи: то, что на форезе вы не видите (или видите очень мало) RNA, вовсе не означает, что ее мало в растворе.
  • RNA - преимущественно одноцепочечная, а одноцепочечные нуклеиновые кислоты связывают EtBr существенно слабее (например, полоса 5S RNA, присутствующей в 4х кратном избытке относительно pDNA, выглядит на форезе в 2-3 раза слабее, чем полоса pDNA);
    RNA могла быть разрушена RNase, при этом оставшиеся нуклеотиды будут поглощать UV так же сильно.

  • Мы предпочитаем брать на анализ небольшую аликвоту и выбрасывать то, что попадает в спектрофотометрическую кювету. Но, в принципе, кювету можно отмыть. Для кварца подходит:
    1. хорошо отмыть детергентом;
    2. если требуется повышенная чистота, вымачивать ~2h в метанол:соляная кислота=1:1;
    3. сполоснуть H2O.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100